1. ВЪВЕДЕНИЕ
Протеиновият еквивалент на геномиката се нарича протеомика. Терминът „протеомика“ е дефиниран за първи път през 1996 г. от Wilkins et al. за описание на пълното съдържание на протеини в клетка, тъкан или организъм чрез систематичен подход. Протеомиката, като клон на молекулярната биология, е привляква вниманието на изследователите, тъй като предоставя общ преглед на протеините в биологичните системи. Протеомиката включва набор от техники, които позволяват идентифициране и количествено определяне на експресираните в клетката протеини. Тези техники дават информация за триизмерната структура на протеините и начините им на взаимодействие. Тъй като белтъчните взаимодействия са в основата на предаването на сигнали в различни регулаторни процеси, системното класифициране на тези взаимодействия може да изясни моделирането на белтъчните комплекси и принципите на тяхното разпознаване на молекулярно ниво.
Протеомиката, в съчетание с останалите омични технологии, също така допринася за разкриването на механизмите на основни клетъчни процеси (в контекста на физиологията, метаболизма и екологията) и за насърчаване на практическото приложение на тези открития в областта на биомедицината, клиничните изследвания, микробиологията на околната среда, микробната екология и биотехнологията на околната среда.
Протеомиката спомага да се предвиди генният продукт въз основа на неговата ДНК последователност, като по този начин улеснява разширяването на техническите инструменти в молекулярната биология и допълва геномните подходи, базирани на нуклеинови киселини. Протеомиката може да се използва за филогенетични изследвания и класификация на микроорганизмите, като се използват двуизмерни карти на белтъчните последователности, получени чрез MS анализи.
Протеомиката на околната среда е една област на приложение на протеомиката с големи перспективи за изучаване на въздействието на средата на растеж върху развитието на организмите в естествени, неконтролирани условия. Въпреки че този клон на протеомиката е сравнително по-слабо развит, той е незаменим инструмент, който използва химията на протеините за решаване на неизяснени въпроси, свързани с околната среда.
Екологичната протеомика е изправена пред сериозни предизвикателства по отношение на ефективността и интерпретацията на данните. Тя работи в неконтролирана среда, извън стандартизираните лабораторни условия. Екологичната протеомика се занимава с въпроси, свързани с некултивируеми организми, чиито геноми не са секвенирани. Освен това извличането на протеини от почвени или водни проби е друго предизвикателство, чието преодоляване е съществена предпоставка за провеждането на протеомни изследвания.
Екологичната протеомика изучава предимно физиологията, метаболизма и екологията на микроорганизмите в естествена среда. Това са местообитания, населени с гъсти и многобройни популации. Повечето микробни видове са некултивируеми, а тяхната физиология и взаимодействие са почти неизвестни. Въпреки това техният биохимичен потенциал под формата на специфични метаболитни способности (т.е. метаногенеза, денитрификация, дехалогениране, редукция на сулфати и т.н.) привлича вниманието на изследователите и специалистите в областта на биотехнологиите като потенциални участници в дейностите, свързани с биотехнологиите на околната среда. От друга страна, особен интерес представлява способността на някои видове да използват разнообразни донори и акцептори на електрони, да са устойчиви на токсични вещества и радиация или да оцеляват при тежки екстремни условия на околната среда (напр. засушаване, глад, процеси на замразяване/размразяване и др.). Екологичната протеомика изяснява явления, като синтропизъм, обмена на гени, комуникацията между клетките, на молекулярно ниво благодарение на възможността за работа в микробни общности – формата, в която микробните популации функционират естествено.
Екологичната протеомика е мощна стратегия и методологичен подход за разкриване на пълния микробен потенциал в тези направления, като се изследват профилите на протеинова експресия в различни екологични условия. Разработените през последното десетилетие високопроизводителни техники за разделяне на протеини (като 2D PAGE, LC, изотопно кодирано афинитетно етикетиране (ICAT)), заедно с напредъка на техниките за анализ на протеини (като MS и търсене в бази данни), подобриха и улесниха процедурите за бързо и надеждно идентифициране на протеини.
Напредъкът в биоинформатиката също допринася значително за идентифицирането на протеини от некултивируеми организми. Стратегиите за прилагане на междувидова идентификация на белтъци и търсене на сходство на белтъчните последователности помагат за идентифицирането на белтъци без наличието на съответните геномни последователности.
2. ПРОТЕИНОВОТО РАЗНООБРАЗИЕ НА ЕКОСИСТЕМИТЕ И ОБЩНОСТИТЕ
Технологичният напредък в използването на методи за охарактеризиране на протеини от некултивируеми организми (т.нар. метапротеомика) откри перспективи за каталогизирането на протеини, като по този начин се създадоха два подсектора на протеомиката, които разкриват тяхното изобилие и разнообразие:
- Протеомика на съобществата: каталогизиране на протеините на съставните видове на съобществата;
- Протеомика на околната среда: каталогизиране на протеините на елементитена екосистемата, дори ако липсват познания за организмите, които произвеждат тези протеини.
Първите подобни проучвания бяха насочени към сравнително несложни групи, включващи предимно микроорганизми, обитаващи екстремни местообитания, като листната микрофлора или проби от морска вода и почва. Резултатите от тези проучвания са от решаващо значение за напредъка на протеомиката на околната среда. Те оформят диференциални профили на синтез и експресия на протеини, отразяващи физиологичните и метаболитните реакции на организма към промените в условията. Тези колебания (както в норма, така и в условия на стрес, включително климатични изменения) водят до промени в състава и количеството на белтъците, които, въпреки че се анализират най-лесно при микробните популации, биха могли да хвърлят светлина върху промените в глобални материални и енергийни потоци, в рамките на екосистемите или между тях.
Отвъд тези значими открития, все още не е ясно дали резултатите, получени при микробни съобщества, могат да бъдат екстраполирани към по-сложни по брой и разнообразие сухоземни и водни екосистеми. Например в микробните съобщества липсват компонентите на сложните хранителни мрежи, които се състоят от взаимодействащи си прокариоти и многоклетъчни еукариоти (т.нар. макробиални еукариоти). От друга страна, макробиалните системи са изправени пред технически предизвикателства, които трябва да бъдат преодоляни, по-специално:
- Идентифициране на протеини от видове, чиито геноми не са секвенирани;
- Разлики между физичната и биологично активната конформация на протеините;
- Разлики в активността на нативните и изолираните протеини;
- Технически трудности при извличането на протеини от сложни матрици (напр.вода или почва), достатъчно надеждно, за да бъде отговорено на целите на изследването.
Високопроизводителните техники и биоинформатичните подходи отговарят на тези предизвикателства, като генерират ценна информация на ниво протеини – най-прякото ниво за измерване на молекулярните фенотипни модели на екосистемата микро-макроорганизми.
3. КАТЕГОРИИ ПРОТЕОМНИ ПРОУЧВАНИЯНА ОКОЛНАТА СРЕДА
3.1. Лабораторни изследвания на моделни микроорганизми от околната среда
Понастоящем повечето протеомни изследвания на микроорганизми от околната среда се извършват с добре познати моделни микроби, които лесно се култивират при контролирани условия в лабораторията. Тези видове се избират поради техните съществени за околната среда характеристики, като способността им да понасят, разграждат или утаяват вещества, токсични за сухоземни/водни местообитания, както и дълбоката им гъвкавост по отношение на електронните донори/акцептори, въглеродните и енергийните източници. Екологичната протеомика може да допринесе за изясняване на техните функции в специфични местообитания и да подобри потенциалното им приложение в екологичните биотехнологии. Освен това геномите на всички тези микроби са секвенирани или могат лесно да бъдат секвенирани, което улеснява разбирането на функциите им в гореспоменатите специфични местообитания и лесното получаване на техните протеомни профили. Протеомните изследвания върху някои групи микробни видове и постиженията, разкриващи уникалните им метаболитни способности, са изброени в таблица 3.1.
Таблица 3.1. Протеомни изследвания на различни микробни видове и постижения на изследванията.
| Микробна група | Обект от интерес | Протеомни изследвания |
| g. Bacillus | – Представители на g. Bacillus – моделни грам-положителни бактерии с космополитно разпространение;
– Атрактивни характеристики, повишаващи оцеляването при стресови условия (спорулация, образуване на биофилм, вирулентност на някои видове); – Добре разработени инструменти на молекулярната биология за манипулиране на гените. |
– Протеомни анализи на B. subtilis за разкриване на физиологични характеристики;
– Пълно картографиране на протеома на представители на g. Bacillus; – Протеомни изследвания за изясняване на поведението в екстремни среди на регулаторно ниво; – Протеомни анализи за образуването на биофилми. |
| g. Pseudomonas | – Добре разработени техники за култивиране;
– Разнообразен метаболизъм (авто/литотрофен) по отношение на използването на C и енергийни източници, разлагане в зависимост от O2 ; – Биодеградация на ксенобиотици (алифатни и ароматни въглеводороди); – Устойчивост на неразградими замърсители. |
– Протеомни анализи за образуването на биофилми;
– Протеомни анализи за изясняване на метаболитната способност за разграждане на токсични съединения; – Протеомни анализи за характеризиране на хранителните изисквания, свързани с техния гъвкав метаболизъм. |
| g. Halobacterium | – Атипичен метаболизъм – метаболитна способност за оцеляване в условия на стрес, свързан с осмоларитета (високо/хипер солена среда);
– Атрактивни за провеждане на промишлени биопроцеси. |
– Протеомни изследвания за изясняване на физиологичните възможности и процесите на хоризонтален генен трансфер в еволюционен контекст;
– Протеомни подходи за създаване на ефикасни процедури за търсене на халофилни ензими. |
| Сулфат-редуциращи бактерии от g. Geobacter и Desulfovibrio | – Метаболитно разнообразие при използването на въглеродни източници;
– Приложение в биоремедиацията.
|
– Описан е протеомът на Geobacter sulfurreducens и са анотирани повечето генни продукти;
– Протеомни анализи за разкриване на метаболитните пътища за редукция на метали; – Транскриптомика на Desulfovibrio vulgaris – идентифициране на генни продукти и определяне на функциите на хипотетични протеини. |
| Метилотрофни бактерии | – Активна роля в метаногенезата в естествена и модифицирана екологична система. | – Транскриптомни изследвания на Methylococcus capsulatus (Bath) и Methylobacterium extorquens: идентифициране на диференциално регулирани протеини;
– Анализи на транскриптома по време на колонизацията на растенията – идентифициране на специфични за органите протеини; |
| Денитрифициращи бактерии / дехалогенератори | – Приложение в биоремедиацията
|
– Протеомни изследвания за оценка на отговора към стрес от околната среда – регулаторни механизми на пътищата на толуена и етилбензола;
– Откриване на специфични за метаболитния път субпротеоми в резултат на метаболитната и регулаторната пластичност; – Протеомни изследвания на дехалогенераторите – възможност за дехалогениране на различни субстрати в зависимост от набора от ензими (експресия на редуктивни дехалогенази) |
| Ферментативни бактерии и дрожди | – Биотехнологично приложение | – Протеомни изследвания за по-добро разбиране на стратегиите за оцеляване при екстремни условия на околната среда по време на ферментационните процеси;
– Протеомни анализи на LAB и синтропични бактерии (с метаногени) и S. cerevisiae за разкриване на повишената експресия на определени гени/пътища; |
| Цианобактерии / фотосинтезиращи бактерии | – Биотехнологично приложение | – Протеомни изследвания за изясняване на поведението на микробите в условия на стрес при сравняване на начина на живот |
3.2. Протеомни изследвания в естествени микробни общности
3.2.1. Метапротеомика
Протеомните изследвания надграждат данните от геномиката, тъй като протеомът на една жива система отразява работата на нейните ензими при конкретни условия. Освен това протеомните анализи обогатяват профилите на генна експресия, получени чрез прилагане на микрочипове, с информация за посттранслационните модификации на протеините. Така протеомиката се оказва подходящ метод за всички микроорганизми, а не само за тези, при които генетичната информация е секвенирана.
Естествените микробни местообитания представляват сложни общности, при които подходът за изследване на протеомиката на околната среда може да допринесе значително за изясняване на структурата и функциите на микробните консорциуми. Именно този глобален анализ на микробните общности в околната среда се нарича метапротеомика. Подходът за метапротеомичен анализ разглежда микробните общности като жив метаорганизъм. Всяка физиологична промяна в този метаорганизъм, регистрирана на протеомно (т.е. популационно) ниво, може да се интерпретира като функционален отговор на промените в околната среда. Друга причина микробните консорциуми да се разглеждат като цял организъм, а не като проста колекция от отделни микроби, е способността на тези метаорганизми да обменят гени и да споделят метаболитни възможности.
От техническа гледна точка метапротеомният подход предоставя голямо предимство в сравнение със стандартните биохимични/молекулярно-биологични анализи, тъй като при него се пропускат трудоемките стъпки на изолиране и поддържане на чисти култури и всички видове, съставляващи определен микробен консорциум. Освен това метапротеомиката разкрива многостранните взаимоотношения между микроорганизмите в рамките на дадена общност. Такава информация не може да бъде получена чрез изследване на чисти култури.
Вярно е, че протеомните изследвания представляват по-голяма трудност от тези с чисти култури. Популационните проби, подложени на протеомен анализ, са сложни по съдържание и структура, като включват голям обем ORF, които трябва да бъдат изследвани за откриване на предполагаеми гени. Този огромен брой генни продукти прави обработката и интерпретацията на данните доста трудна, тъй като за повечето представители на консорциумите няма данни за секвениране на генома. Анализът in silico, който опосредства анотацията на генните продукти, също е от решаващо значение за успеха на метапротеомните изследвания.
Понастоящем усъвършенстването на методите за извличане на протеини и тяхното идентифициране директно в пробите от околната среда (от водни или почвени местообитания) преодолява пречките, наложени от трудоемките традиционни подходи, и гарантира по-бързи и по-добри резултати. Пиросеквенирането, което постепенно намира приложение в метагеномните изследвания, е добър пример за такъв съвременен метод.
3.2.2. Естествени микробни общности
Метапротеомните изследвания на микробни общности в естествените им местообитания спомагат за изясняването на техни ценни функционални особености. Почвените и водните (морските) микробни съобщества са изследвани с помощта на метапротеомичен подход и е натрупана ценна информация с потенциално практическо приложение.
Например, микробните общности в повърхностните води първоначално са изследвани чрез 1D и 2D SDS-PAGE. Тези методологични подходи доведоха до генериране на протеинови отпечатъци, а за някои от протеините – до тяхното функционално охарактеризиране. Следвайки технологичния напредък, техниката „shotgun“ беше приложена за изучаване на микробните биофилми от течове от киселинни мини. Този подход доведе до идентифицирането на повече от 2000 белтъка, посредством използването на набор от данни за последователности, генерирани от същото местообитание на околната среда. Метапротеомните изследвания бяха използвани за идентифициране на белтъчния набор на отделни щамове, които се оказаха доминиращи в общността. По този начин са натрупани доказателства за хоризонтален трансфер на гени, допринесъл за успешното адаптиране на микроорганизмите към суровите условия в местообитанието на киселинната мина.
Метапротеомните изследвания на почвени микробни общности също напредват. Стъпката, която затруднява методологичните подходи, е липсата на технология, която да позволява директно извличане на протеини от сложната почвена среда. Трябва да се има предвид, че извлечените белтъци трябва да са с достатъчно количество и качество, за да се получат достоверни протеомни данни. В търсене на решение на този проблем учените успяват да генерират отпечатъци от почвения протеом върху моделна матрица от разтворена органична материя. Използвайки този подход, те установиха наличието на изобилие от лаказни и целулазни хидролитични ензими, с потенциал да се използват като индикатори за наличието на активни микроорганизми в определена екосистема. Друг модел, базиран на комплексни матрици на околната среда, е използван за оценка на наличието на целеви микроорганизми в много ниски концентрации (около 6 %).
Тези данни се препоръчват за оценка на наличието на потенциални причинители на биологични заплахи, отразявайки числеността на оскъдните видове.
3.2.3. Значение на функционалното разнообразие на микробните общности от гледна точка на протеомиката
Изследването на протеиновия набор в живите системи придобива все по-голяма популярност. Съответно се увеличава и обемът на въвежданите биоинформатични данни. Освен тези солидни информационни потоци по отношение на структурата и функцията на протеините, пряката връзка на структурата и функционирането на микробните общности с екосистемата и оценката на индивидуалните протеинови профили е трудна. За да се разкрие функционалната значимост на протеиновото разнообразие в екосистемата, трябва 1) да се характеризира протеиновото разнообразие и 2) да се анализира протеомната съвкупност. За тази цел се използват моделни системи при контролирани условия, които свързват експерименталните данни с конкретния статистически модел. Идентифицирането на белтъците и относителното количествено изобилие в моделните системи са задължителна първа стъпка при този подход. Не е възможно да се определи абсолютното количество и цялото белтъчно разнообразие в дадена екосистема. Отчетените стойности достигат 1×104 – 109, дори 1010 в протеинови съвкупности, съдържащи както про-, така и еукариоти. Тъй като данните за биологичното разнообразие и тези от протеомиката на околната среда показват значително сходство, когато се сравняват чрез метода на пробовземане, статистическите методи, използвани за анализ на биологичното разнообразие, могат да бъдат приложени и към данните от протеомиката на околната среда. Този взаимен аналитичен подход ще спомогне за по-нататъшното изследване на моделите на протеомното разнообразие и за оценка на функционалната им значимост.
Benndorf et al. (2007) са създали протокол за метапротеомен анализ на подземни води и почви, насочен към разкриване на функционалните аспекти на определена микробна общност.
4. ИЗСЛЕДВАНИЯ И ОБЛАСТИ НА ПРИЛОЖЕНИЕ НА ПРОТЕОМИКАТА НА ОКОЛНАТА СРЕДА
4.1. Метаболитно инженерство
Метаболитното инженерство е мултидисциплинарен научен клон за получаване на целеви продукти чрез манипулиране на метаболитните характеристики на организма-гостоприемник. Като съществен елемент от ефективния дизайн на протеините, метаболитното инженерство допринася за биосинтеза на протеини с добавена стойност при висока производителност. Освен голямото си предимство при проектирането и производството на целеви продукти чрез оптимизиране на генетичните и регулаторните процеси в рамките на клетъчните продуценти, метаболитното инженерство се сблъсква с някои пречки, които подкопават практическото му приложение. Например, заедно с производството на извънклетъчен протеин клетката-гостоприемник претърпява физиологични промени, които оказват влияние върху други клетъчни процеси, особено върху производството на други нейни протеини. Протеомните анализи могат значително да допринесат за разбирането на отговора на клетката-гостоприемник към експресията на хетероложни гени, тъй като процесът се катализира и/или регулира от протеини или протеинови комплекси и промените в тяхното производство могат да бъдат предвидени покрай експресията на екзогенните гени. Протеомният анализ предоставя ценни данни по време на хетероложната експресия на вътреклетъчни ензими, основани на този фундаментален модел на действие по време на метаболитното инженерство. Примери за това са експресията на глутатион S-трансфераза и епоксид хидролаза (основни компоненти на клетъчната ензимна антиоксидантна защитна система). Чрез подхода на количествена протеомика Lee et al. (2006) установяват, че прилагането на тази стратегия за метаболитно инженерство води до индукция на ензимите от пируватния метаболизъм, синтеза на глутатион и антиоксидантната защита, както и до репресия на ензимите от глюконеогенезата, ТАС, синтеза на индол и синтеза на мастни киселини.
Чревният микроб Escherichia coli, въпреки че не е характерен за почвата и водната среда, но е използван като класически гостоприемник за метаболитно инженерство, също е широко проучен с инструментите на екологичната протеомика. Анализите на поведението на E. coli в екологичен контекст, основани на изследване на протеома на метаболитно инжениран за биоразграждане на трихлоретен щам E. coli, с въведени шест гена от щама Burkholderia cepacia G4, показаха, че физиологията на щам-гостоприемника е променена поради въвеждането на гените.
4.2. Микробна екология
Традиционните екологични изследвания търсят естествено предизвикано приспособяване на бактериите към околната среда. Екологичната протеомика има принос към тези изследвания, тъй като дава представа за механизмите на адаптация, особено при екстремни условия на околната среда (напр. хипертермофилни). Така например хипертермофилните протеини са във фокуса на изследванията поради повишената им конформационна стабилност и оперативност при високи температури. Изучаването на този феномен води до разкрития относно молекулярните механизми на сгъване на протеините. Prosinechki et al. (2006) са изследвали хипертермофилен археон, принадлежащ към g. Sulfurispharea, който може да расте в температурния диапазон 70 – 97оС. Използвайки техниката за динамично смущаване на протеома, те са идентифицирали протеини с по-висока стабилност, участващи в основни клетъчни процеси – детоксикация, обработка на нуклеинови киселини, енергиен метаболизъм и др.
Изследването на другия температурен екстремум – студът, също допринесе за разкриването на механизмите за адаптация на микроорганизмите. Прилагайки протеомен анализ, Qiu et al. (2006) изследват адаптацията към ниски температури на щам Exiguobacterium, изолиран от сибирски вечно замръзнали седименти. Комбинирайки хроматофокусиране и MS, авторите идентифицират над 250 протеина, които са уникално или преференциално експресирани при 4оC. Те идентифицират протеини за студова климатизация и студов шок, които представляват клетъчна стратегия за адаптация, посредством регулиране на физиологичните процеси на база регулиране на отделни клетъчни протеини. Предполага се, че белтъците, които се регулират при по-ниски температури, позволяват на клетките да се адаптират към температури, близки до или под нулата. Протеомните изследвания могат да допринесат за доказване на хипотезата за бактериалната студова адаптация. Необходими са обширни протеомни изследвания, които да предоставят информация за целия протеинов ансамбъл на клетката и нейното функциониране. Малките набори от белтъци, изследвани в специфичен функционален контекст, не представят коректно общата картина. Този факт се доказва от друго проучване с Colwellia psychrerythraea, при което са доказани промени в флуидността на клетъчната мембрана, синтеза и усвояването на съединенията на криотолерантността и стратегиите за преодоляване на температурно зависимите бариери пред усвояването на С.
Комбинираният ефект на два различни абиотични стресови фактора – сол и студ, е доказан при Psychrobacter sp.от Zheng et al. (2006). Идентифицирани са различни протеини при адаптация към студ в присъствие на сол, което показва комбиниран ефект върху белтъчната експресия.
4.3. Устойчивост на стрес от околната среда
Голямото предимство на протеомиката за идентифициране на протеини без геномно секвениране прави този молекулярен подход универсален инструмент за разбирането на физиологичните реакции към условията на абиотичен стрес в околната среда. Способността на протеомиката да предложи общосистемна информация за микроорганизмите в тяхната естествена среда подтиква към нейното прилагане при оценката на отговора на микроорганизмите към термични, химични, оксидативни и други стресове. 2D SDS PAGE и хроматографски базираните протеомни изследвания са двата най-изследвани метода за изучаване на механизмите на толерантност към ниски и високи температури, ниско pH, тежки метали и оксидативен стрес. Тези изследвания доказаха повишаването на регулацията на добре познати протеини при реакции на стрес и регистрираните протеини, участващи в други дейности за адаптация/детоксикация, като липидни биосинтетични пътища, натрупване на осмопротектори, нови транспортни протеини и др.
Освен това стана ясно, че регулацията на стресовия отговор може да бъде диференцирана в случай, че един вид е подложен на различни стресове. Типичен пример за това наблюдение е Desulfovibrio vulgaris, изложен на високи концентрации на сол, нитратен стрес и повишени температури. Протеомните анализи разкриха модели на повишената и понижената регулация на белтъците/белтъчните системи при различните стресови условия. Установено е, че D. vulgaris реагира по сходен начин на стреса, причинен от NaCl и KCl. Има разлика обаче между реакцията на нитратен стрес и реакцията на високи температури. Освен това протеомното изследване предполага посттранслационна модификация на шапероните на протеините. Всички тези данни показват, че протеомният анализ разкрива реакциите на стрес в цялата система, заедно със специфичните защитни механизми, приписвани на всяко стресово състояние.
5. ПОТЕНЦИАЛ НА ПРОТЕОМИКАТА НА ОКОЛНАТА СРЕДА
5.1. Методологични и технически иновации
В рамките на четвъртвековната си история протеомиката претърпя трансформация от биохимичен анализ на отделни протеини към техника за съпоставяне на много различни характеристики на протеините, като модели на експресия, структура, локализация, взаимодействия и модификации, на всеки етап от развитието на живите системи. Протеомиката цели да се изследва динамиката на протеома на организма по време на неговото развитие.
От технологична гледна точка протеомиката разчита на последните технологични постижения, за да постигне своята научна цел. Разработването на 2D електрофореза в края на 90-те години на миналия век позволи за пръв път да се картографира целият протеом. По-късно технологиите за секвениране на белтъци засилиха развитието на протеомиката и спомогнаха за разкриване на пълния ѝ капацитет при идентифицирането и охарактеризирането на белтъци. Високата чувствителност на анализа, предлагана от масовата спектрометрия (MS), и свързването ѝ с допълнителни технологии в газова фаза (напр. спектрометрия на йонната подвижност) превърнаха MS в основна аналитична методика в протеомния анализ.
Методите за екстракция и дериватизация на протеини, съчетани с гореспоменатите подходи за разделяне, допринасят за способността на изследователите да разграничават отделните елементи от сложни протеинови смеси.
И накрая, обработката и интерпретацията на огромното количество необработени протеомни данни, натрупани по време на експерименталните етапи на изследванията, се подпомагат от постоянно усъвършенстваните методи за биоинформатичен анализ, които улесняват придобиването на по-дълбока представа за биологичните функции и тяхното регулиране в живите системи. Биоинформатиката, като интегриран клон на математиката, биостатистиката и компютърните анализи на биоданни от геномни и протеомни изследвания чрез сложни инструменти, подпомага анотирането и интерпретирането на експерименталните резултати. Освен това този методологичен подход помага при проектирането на молекули, които могат да взаимодействат с интересуващите ни белтъци, и при прогнозирането на взаимодействия белтък-белтък. Така биоинформатиката придобива съществено значение за превръщането на първичните данни от протеомиката в знания за тяхното приложение.
Въпреки това, наред с тези технологични постижения, методологията на протеомиката има ограничения, които възпрепятстват универсалното ѝ приложение. Например все още не е възможно да се получат данни за общия пул от протеини, представени в дадена проба, поради техния концентрационен диапазон, който е доста голям, както и поради липсата на подходяща методология за усилване на протеини, чиято концентрация е много ниска.
В таблица 3.2 са представени последните технологични разработки на основните групи методологии на протеомиката, като се акцентира върху техните предимства, „спирачките“ в работата и новите постижения в областта на техниката. Схемата на фиг. 3.1 очертава как тези методологични подходи са организирани в работния процес на протеомиката.
Таблица 3.2. Обзор на последните технологични разработки на основните групи методики на протеомиката.
| Метод | Предимства | Трудности при възпроизвеждането | Нови разработки |
|
Индивидуални методи |
|||
| 2D полиакриламидна гел-електрофореза (2D-PAGE) – метод за разделяне на протеини въз основа на тяхната маса и заряд (изоелектрични точки) |
|
|
|
| Течна хроматография (LC) – метод за количествено разделяне и идентифициране на съединения в сложни смеси |
|
|
|
| Изотопно кодирано афинитетно маркиране (ICAT-маркиране) – метод за относително количествено определяне въз основа на маркирани пептиди като вътрешни стандарти |
|
|
|
| Масспектрометрия (MS) – техника за определяне на масата, адаптирана за идентифициране на протеини, основана на подхода на съотношението маса-заряд (m/z) и използването на различни методи за йонизация: |
|
|
|
|
|
|
|
| Фагов дисплей – създаване на библиотеки от пептиди/протеини върху вирусни повърхности и проверка на активността им |
|
||
| Клониране на лиганди (пептиди), които се свързват с по-големи домени в протеините |
|
||
|
Подходи на свързаните методологии |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Фигура 3.1. Схематично представяне на работния процес на протеомните технологии. Източник: Cho, 2007 г.
5.2. Експерименталната протеомика на околната среда накратко
Екологичната протеомика може да разшири познанията ни за това как протеините взаимодействат в дадена екосистема или поне в група от видове. Разбирането на механизмите на това взаимодействие ще разкрие факти относно протичането на екологичните процеси. Подход, групиращ белтъците въз основа на техните биохимични свойства, субклетъчна локализация и биопроцеси, в които те участват, изглежда разумен и информативен, за да се разбере функционалното значение на белтъците в екосистемата. В този контекст базите данни с генна онтология, които класифицират протеините във функционални категории, са добър вариант, а протеомиката може да допринесе за генерирането на нови екологични прозрения, тъй като предоставя информация за функционално еквивалентни протеини, произвеждани от (микро)организми, обитаващи сходна среда. Поради тази причина, е по-добре, вместо да се характеризира целият протеинов пул в дадена съвкупност, да се съсредоточим върху ограничен брой протеини, за които е установено, че променят количеството си като отговор на условията на околната среда. Експериментално екологът може да добави или премахне вид от дадено съобщество и да установи кой от тях е отговорен за реакцията към даден фактор на средата. Описаният подход, наречен молекулярно фенотипиране на асамблея, допринася за познанията ни за функционирането на протеините и тяхната динамика във времева перспектива. Това ще помогне на еколозите да прогнозират кои протеини играят съществена роля в екосистемата.
Освен това експерименталната производителност при синтезирането на протеини in vitro ще помогне на еколозите при проектирането на специфични експериментални мезокосми, като модели на хранителни мрежи и проследяване на съдбата на протеините в тях при различни условия на околната среда, или обогатяването на екосистемите с потенциално важни протеини и метаболити и измерването на реакциите на хранителните мрежи. По този начин количественото определяне на екологичния протеом и измерването на реакцията на биоразнообразието при добавяне/отстраняване на видове от екосистемата или добавяне на изкуствено синтезирани протеини към нея ще даде задълбочена информация относно функциите на протеините в екосистемната организация.
6. ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВА, ГРАНИЦИ И ПЕРСПЕКТИВИ НА ПРОТЕОМИКАТА НА ОКОЛНАТА СРЕДА
Протеомиката е мощен клон на омиките с потенциал да разшири по-нататъшните изследвания в областта на микробиологията, микробната екология и биотехнологиите на околната среда. Понастоящем повечето от изследванията на протеомиката на околната среда с микроорганизми са лабораторни. Първите метапротеомни изследвания разкриват способността на протеомиката да допринесе за идентифицирането и характеризирането на белтъците в рамките на микробни консорциуми, въпреки че липсват данни за секвениране или филогенични особености. Едно от най-съществените предизвикателства пред екологичната протеомика, е необходимостта от разработване на методи за извличане на протеини от микробни общности в различни среди (почва, води). Освен това напредъкът в биоинформатиката и нейните инструменти също се очаква да подобри идентифицирането на пептиди и протеини от суровите данни на метапротеомиката.
Протеините изграждат клетъчните структури, генерират енергия, подпомагат комуникацията и позволяват възпроизвеждането. По този начин те осигуряват структурните и функционалните мрежи на живата клетка. Докато генетичната информация е статична, протеиновият компонент на клетката е динамичен. Добре известно е, че протеините са много по-сложни и трудни за работа от нуклеиновите киселини (ДНК и РНК). Това предизвикателство провокира изследванията върху пептидите/протеините и оформи перспективите на протеомиката по отношение на:
- Физични/химични свойства на протеините. Това са вторичните и третичните структури, които трябва да се имат предвид и да се поддържат по време на анализа; процеситена денатурация и съответните потенциални денатуриращи фактори: ензими, температура, облъчване, механични сили и т.н.; проблемите с разтворимостта на протеините, които трябва да се решат.
- Количествено определяне на протеините. Трябва да се вземе предвид, че протеините не могат да бъдат амплифицирани като ДНК и когато не са в изобилие, не могат да бъдат открити. Наскоро разработената технология от Thulasiraman et al. (2005) изследва мънистас библиотека от лиганди, които позволяват достъп до много протеини в незначителни концентрации и са практически неоткриваеми чрез класическите аналитични техники. Този подход води до проследяване на концентрацията на белтъците върху техните специфични афинитетни лиганди.
- Микрочипове и чувствителност към протеини. Nettikadan et al.(2006) предлагат техника, която съчетава микрочипове и скрининг на малки обеми проби, за да проектират така наречените ултрамикрочипове, които предлагат висока специфичност и висока чувствителност, преодолявайки проблема с малките обеми и количествата протеини. Този стратегически подход дава надеждни техники за справяне с ограничените количества протеини.
- Интегриране на мултиомиката. Интегрирането на протеомиката с геномиката и метаболомиката все още е предизвикателство, но притежава потенциала да разкрие функционалното разнообразие на протеините. По този начин протеомиката допринася за развитието на функционалната геномика в полза на биомедицинските изследвания и оказва влияние върху разработването на иновативни продукти за диагностика и терапия.
7. ИЗТОЧНИЦИ
Andersson, T., et al. (2007). Automating MALDI sample plate loading. J. Proteome Res. 6: 894-896.
Benndorf, D., Balcke, G.U., Harms, H., et al. (2007). Functional metaproteome analysis of protein extracts from contaminated soil and groundwater. ISMEJ 1:224–34.
Biddle, J.F., Fitz-Gibbon, S., Schuster, S.C., et al. (2008). Metagenomic signatures of the Peru Margin subseafloor biosphere show a genetically distinct environment. Proc Natl Acad Sci USA 105:10583–8.
Bogan, M.J. and Agnes, G.R. (2004). Wall-less sample preparation of microm-sized sample spots for femtomole detection limits of proteins from liquid-based UV-MALDI matrices. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15: 486-495.
Cho, W.C.S. (2007). Proteomics Technologies and Challenges. Geno. Prot. Bioinfo. Vol. 5 No. 2 2007 77-85
Cho, W.C. and Cheng, C.H. (2007). Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev. Proteomics 4: 401-410.
Dopson, M., Baker-Austin, C., Bond, P.L. (2004). First use of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis to determine phylogenetic relationships. J Microbiol.Methods 58:297–302.
Dworzanski, J.P., Snyder, A.P. (2005), Classification and identification of bacteria using mass spectrometry-based proteomics. Exp Rev Proteomics 2:863–78.
Gulmann, C., et al. (2006). Array-based proteomics: mapping of protein circuitries for diagnostics, prognostics, and therapy guidance in cancer. J. Pathol. 208: 595-606.
Hecker, M., Volker, U. (2004). Towards a comprehensive understanding of Bacillus subtilis cell physiology by physiological proteomics. Proteomics 4:3727–50.
Kim, W.K., et al. (2006). The many faces of protein protein interactions: a compendium of interface geometry. PLoS Comput. Biol. 2: e124
Lauber, W.M., et al. 2001. Mass spectrometry compatibility of two-dimensional gel protein stains. Electrophoresis 22: 906-918.
Lee, J., Cao, L., Ow, S.Y., et al. (2006). Proteome changes after metabolic engineering to enhance aerobic mineralization of cis-1,2-dichloroethylene. J ProteomeRes 5:1388–97.
McCormack, A.L., et al. (1997). Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level. Anal. Chem. 69: 767-776.
Methe,´ B.A., Nelson, K.E., Deming, J.W. (2005). The psychrophilic lifestyle as revealed by the genome sequence of Colwellia psychrerythraea 34H through genomic and proteomic analyses. ProcNatl Acad SciUSA 102:10913–8.
Nettikadan, S., et al. (2006). Detection and quantification of protein biomarkers from fewer than 10 cells. Mol. Cell. Proteomics 5: 895-901.
O’Farrell, P. H. (1975). High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007–4021. doi:10.1016/S0021-9258(19)41496-8
Prosinecki, V., Botelho, H.M., Francese, S. (2006). A proteomic approach toward the selection of proteins with enhanced intrinsic conformational stability. J Proteome Res 5: 2720–2726.
Qiu, Y.H., Kathariou, S., Lubman, D.M. (2006). Proteomic analysis of cold adaptation in a Siberian permafrost bacterium – Exiguobacterium sibiricum 255-15 by two-dimensional liquid separation coupled with mass spectrometry. Proteomics 6:5221–33.
Ram, R.J., VerBerkmoes, N.C., Thelen, M.P., et al. (2005). Community proteomics of a natural microbial biofilm. Science 308: 1915–20.
Reardon, K.F. (2009). Environmental proteomics: Applications of proteome profiling in environmental microbiology and biotechnology Briefings in Functional Genomics and Proteomics 8:1. 75-87 doi:10.1093/bfgp/elp005
Shevchenko, A., Sunyaev, S., Loboda, A., et al. (2001). Charting the proteomes of organisms with unsequenced genomes by MALDI-quadrupole time of flight mass spectrometry and BLAST homology searching. Anal Chem;73: 1917–26.
Schulze, W.X., Gleixner, G., Kaiser, K., et al. (2005). A proteomic fingerprint of dissolved organic carbon and of soil particles. Oecologia 142:335–343.
Schweder, T., Markert, S., Hecker, M. (2008). Proteomics of marine bacteria. Electrophoresis 29:2603–16.
Thulasiraman, V., et al. (2005). Reduction of the concentration difference of proteins in biological liquids using a library of combinatorial ligands. Electrophoresis 26: 3561-3571.
Torsvik, V., Ovreas, L., Thingstad, T.F. (2002). Prokaryotic diversity – magnitude, dynamics, and controlling factors. Science 296:1064–6.
VerBerkmoes, N.C., Hervey, W.J., Shah, M., et al. (2005). Evaluation of ‘‘Shotgun’’ proteomics for identification of biological threat agents in complex environmental matrixes: Experimental simulations. Anal Chem 77:923–932.
Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D.F., et al. (1996). Progress with Proteome Projects: Why All Proteins Expressed by a Genome Should Be Identified and How to Do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13, 19–50. doi:10.1080/02648725.1996.10647923
Zheng, S.P., Ponder, M.A., Shih, J.Y. (2007). A proteomic analysis of Psychrobacterarticus 273-4 adaptation to low temperature and salinity using a 2-D liquid mapping approach. Electrophoresis 28:467–488.
Zieske, L.R. (2006). A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. J. Exp. Bot. 57: 1501-1508.
