1. GİRİŞ
Genomiğin protein eşdeğeri proteomik olarak adlandırılır. Proteomik terimi ilk kez 1996 yılında Wilkins ve arkadaşları tarafından bir hücre, doku veya organizmadaki tüm protein içeriğini sistematik bir yaklaşımla tanımlamak için tanımlanmıştır. Bir moleküler biyoloji dalı olan proteomiks, biyolojik sistem proteinlerine genel bir bakış sağladığı için araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Proteomiks, hücrede ifade edilen proteinlerin tanımlanmasına ve nicel olarak belirlenmesine olanak tanıyan bir dizi teknolojiden oluşmaktadır. Bu teknikler proteinlerin üç boyutlu yapılarını ve etkileşim biçimlerini ortaya koymaktadır. Protein-protein etkileşimleri, çeşitli düzenleyici olaylarda sinyal iletiminin temelini oluşturduğundan, bu etkileşimlerin sistematik olarak sınıflandırılması, protein komplekslerinin modellenmesinin ve moleküler düzeyde tanınma ilkelerinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Proteomiks, omiks teknolojilerinin geri kalanıyla birlikte, temel hücresel süreçlerin (fizyoloji, metabolizma ve ekoloji bağlamında) mekanizmalarının keşfedilmesine ve bu bulguların biyotıp, klinik araştırmalar, çevresel mikrobiyoloji, mikrobiyal ekoloji ve çevresel biyoteknoloji alanlarında pratik uygulamalarının teşvik edilmesine de katkıda bulunur.
Proteomik, DNA dizisine dayalı olarak bir gen ürününün tahmin edilmesine yardımcı olur, böylece moleküler biyoloji teknik araçlarının genişletilmesini kolaylaştırır ve genomikte nükleik asitlere dayalı yaklaşımları tamamlar. MS analizleri ile elde edilen protein dizilerinin 2D haritaları kullanılarak mikrobiyal filogenetik çalışmalar ve sınıflandırma için proteomiklerden yararlanılabilir.
Çevresel proteomik, doğal, kontrolsüz koşullarda büyüme ortamlarının organizma gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için büyük umut vaat eden proteomik uygulama alanlarından biridir. Proteomiğin bu dalı diğer uygulamalara göre nispeten daha az gelişmiş olsa da, çevresel belirsizlikleri çözmek için protein kimyasını kullanan vazgeçilmez bir araçtır.
Çevresel proteomik, performans ve veri yorumlama konusunda ciddi zorluklarla karşı karşıyadır. Standartlaştırılmış laboratuvar koşulları olmadan kontrolsüz bir ortamda hareket eder. Çevresel proteomik, genomları dizilenmemiş, kültürü yapılamayan organizmalarla ilgili sorunlarla ilgilenir. Ayrıca, toprak veya su örneklerinden protein ekstraksiyonu, üstesinden gelinmesi proteomik çalışmalar için önemli bir ön koşul olan bir başka zorluktur.
Çevresel proteomik ağırlıklı olarak doğal ortamlardaki mikrobiyal fizyoloji, metabolizma ve ekolojiyi inceler. Bunlar yoğun ve çok çeşitli popülasyonların yaşadığı habitatlardır. Doğal ortamlardaki çoğu mikrobiyal tür kültürlenemez ve fizyolojileri ve etkileşimleri neredeyse bilinmemektedir. Bununla birlikte, spesifik metabolik yetenekleri (örneğin, metanojenez, denitrifikasyon, dehalojenasyon, sülfat indirgeme, vb.) şeklindeki biyokimyasal potansiyelleri, çevresel biyoteknoloji faaliyetlerinde potansiyel katılımcılar olarak araştırmacıların ve biyoteknoloji uygulayıcılarının dikkatini çekmektedir. Öte yandan, bazı türlerin çeşitli elektron verici ve alıcılarını kullanmaları, toksik maddeleri ve radyasyonu tolere etmeleri veya şiddetli çevresel aşırılıklar (örn. kuruma, açlık, donma/çözülme süreçleri vb.) altında hayatta kalma yetenekleri özellikle ilgi çekicidir. Çevresel proteomik, mikrobiyal popülasyonların doğal olarak işlev gördüğü form olan mikrobiyal komunitelerda çalışma potansiyeli nedeniyle sentrofi, gen değişimi ve hücreden hücreye iletişim gibi olgulara moleküler düzeyde içgörü kazandırır.
Çevresel proteomik, farklı ekolojik koşullarda protein ifade profillerini inceleyerek bu yönlerdeki mikrobiyal potansiyelin tamamını ortaya çıkarmaya yönelik güçlü bir strateji ve metodolojik yaklaşımdır. Son on yılda geliştirilen yüksek verimli protein ayırma teknikleri (2D PAGE, LC, izotop kodlu afinite etiketi etiketleme (ICAT) gibi), protein analizi tekniklerinin (MS ve veri tabanı arama gibi) ilerlemesiyle birlikte protein tanımlama prosedürlerini hızlı ve güvenilir bir şekilde geliştirmiş ve kolaylaştırmıştır.
Biyoinformatikteki ilerleme, kültürü yapılamayan organizmalardan protein tanımlanmasına da önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır. Türler arası protein tanımlama ve protein dizisi benzerliği arama stratejileri, ilgili genomik dizilerin mevcudiyeti olmadan proteinlerin tanımlanmasına yardımcı olur.
2. EKOSİSTEMLERİN VE KOMÜNİTELERİN PROTEİN ÇEŞİTLİLİĞİ
Kültürü yapılamayan organizmaların (metaproteomik olarak adlandırılan) proteinlerini karakterize etmeye yönelik yöntemlerin kullanılmasındaki teknolojik ilerleme, proteinlerin kataloglanmasına yönelik umutları artırmış ve böylece protein bolluğunu ve çeşitliliğini ortaya çıkaran iki proteomik alt dalı oluşturmuştur:
- Komünite proteomiği:komünitelerin bileşen türlerinin proteinlerinin kataloglanması;
- Çevresel proteomik: Bu proteinleri üreten organizmalar hakkında bilgi sahibi olunmasa bile ekosistem parçalarının proteinlerinin kataloglanması.
Bu konuda ilk çalışmalar, çoğunlukla yaprak mikroflorası veya bazı deniz suyu ve toprak örneklerinin mikroflorası gibi uç habitatlarda yaşayan mikroorganizmalardan oluşan nispeten karmaşık olmayan komünitelere odaklanmıştır. Bu araştırmaların sonuçları çevresel proteomiklerin ilerlemesi için büyük önem taşımaktadır. Ekolojik koşullardaki dalgalanmalara karşı organizmanın fizyolojik ve metabolik tepkilerini yansıtan farklı protein üretim ve ifade profillerini şekillendirirler. Bu dalgalanmalar (iklim değişikliği de dahil olmak üzere hem normal hem de stres altında) protein bileşimi ve bolluğunda değişikliklere yol açmakta, bu da en iyi mikrobiyal popülasyonlarda analiz edilmesine rağmen, ekosistemler içinde veya arasında küresel madde ve enerji akışındaki değişikliklere ışık tutabilmektedir.
Bu temel bulguların yanı sıra, mikrobiyal komünitelerden elde edilen sonuçların, karasal ve sucul ekosistemlerin unsurlarının sayısı ve çeşitliliği ile daha karmaşık olanlara tahmin edilip edilemeyeceği hala net değildir. Örneğin, mikrobiyal komüniteler, etkileşim halindeki prokaryotlar ve çok hücreli ökaryotlardan (makrobiyal ökaryotlar olarak adlandırılır) oluşan karmaşık besin ağlarının bileşenlerinden yoksundur. Öte yandan, makrobiyal sistemler özellikle üstesinden gelinmesi gereken teknik zorluklarla karşı karşıyadır:
- Genomları dizilenmemiş türlerden protein tanımlama;
- Proteinlerin fiziksel ve biyolojik konformasyonları arasındaki farklar;
- Doğal ve izole edilmiş proteinlerin aktivitelerindeki farklılıklar;
- Karmaşık matrislerden (bkz. su veya toprak) proteinlerin araştırma amacına uyacak kadar güvenilir bir şekilde çıkarılmasındaki teknik zorluklar.
Bununla birlikte, yüksek verimli teknikler ve biyoinformatik yaklaşımlar, mikrop-makrop ekosisteminin moleküler fenotip modellerini ölçmenin en doğrudan seviyesi olan protein düzeyinde değerli bilgiler üreterek bu zorluklara cevap vermektedir.
3. ÇEVRESEL PROTEOMİK ÇALIŞMALARIN
3.1. Model çevresel mikroorganizmaların laboratuvar araştırmaları
Şu anda, çevresel mikroorganizmaların proteomik çalışmalarının çoğu, laboratuvarda kontrollü koşullar altında kolayca yetiştirilebilen iyi bilinen model mikroplarla gerçekleştirilmektedir. Bu türler, karasal/su habitatları için toksik olan maddelere dayanma, bozma veya çökeltme kabiliyeti ve elektron vericileri/alıcıları, karbon ve enerji kaynaklarına karşı derin esneklik gibi çevresel açıdan temel özellikleri nedeniyle seçilmektedir. Çevresel proteomik, belirli habitatlardaki işlevlerinin aydınlatılmasına katkıda bulunabilir ve çevresel biyoteknolojideki potansiyel uygulamalarını geliştirebilir. Ayrıca, tüm bu mikropların genomları dizilenmiştir veya kolayca dizilenebilir, bu da yukarıda belirtilen belirli habitatlardaki işlevlerinin anlaşılmasını ve proteom profillerinin kolayca elde edilmesini kolaylaştırır. Çeşitli mikrobiyal tür gruplarının proteomik çalışmaları ve benzersiz metabolik yeteneklerini ortaya çıkaran araştırma başarıları Tablo 3.1’de listelenmiştir.
Tablo 3.1. Farklı mikrobiyal türlerin proteomik çalışmaları ve araştırma başarıları.
|
Mikrobiyal grup |
İlgi çekici nokta | Proteomik çalışmalar |
| g. Bacillus | – g. Bacillus temsilcileri – kozmopolit dağılıma sahip model Gram pozitif bakteriler;
– Stres koşulları altında hayatta kalmayı artıran çekici özellikler (sporülasyon, biyofilm oluşumu, bazı türlerin virülansı); – Gen manipülasyonu için iyi geliştirilmiş moleküler biyoloji araçları. |
– Fizyoloji özelliklerini ortaya çıkarmak için B. subtilis‘in proteomik analizleri.
– g. Bacillus temsilcilerinin tam proteom haritalaması – Aşırı ortamlardaki davranışları düzenleyici düzeyde aydınlatmak için proteomik çalışmalar; – Biyofilm oluşumu için proteomik analizler. |
| g. Pseudomonas | – İyi geliştirilmiş yetiştirme teknikleri
– C ve enerji kaynaklarının kullanımı açısından çok yönlü metabolizma (oto/litotrofik), O2 bağımlı ayrışma – Ksenobiyotiklerin biyodegradasyonu (alifatik ve aromatik hidrokarbonlar) – Bozunmayan kirleticilere karşı tolerans |
– Biyofilm oluşumu için proteomik analizler.
– Toksik bileşikleri ayrıştırmaya yönelik metabolik kapasitelerini açıklığa kavuşturmak için proteomik analizler – Esnek metabolizmalarıyla ilgili korkutucu besin gereksinimlerini karakterize etmek için proteomik analizler |
| g. Halobacterium | – Atipik metabolizma – ozmolarite stresi (yüksek/hiper tuzlu ortamlar) altında hayatta kalmak için metabolik yetenek;
– Endüstriyel biyoproses performansı için cazip olması
|
– Evrimsel bağlamda fizyolojik yetenekleri ve yanal gen aktarım süreçlerini aydınlatmak için proteomik çalışmalar
– Halofilik enzimlerin araştırılması için etkili prosedürlerinin oluşturulmasına yönelik proteomik yaklaşımlar. |
| Geobacter ve Desulfovibrio gibi sülfat indirgeyen bakteriler | – Karbon kaynaklarının kullanımında metabolik çeşitlilik
– Biyoremediasyonda uygulama
|
– Geobacter sulfurreducens proteomu tanımlanmış ve gen ürünlerinin çoğu açıklanmıştır
– Metal indirgemenin metabolik yollarını ortaya çıkarmak için proteomik analizler – Desulfovibrio vulgaris‘in transkriptomiği – gen ürünlerinin tanımlanması ve varsayımsal işlev ataması |
| Metilotrofik bakteriler | – Doğal ve tasarlanmış çevresel sistemlerde metanojenezde aktif rol | – Methylococcus capsulatus (Bath) ve Methylobacterium extorquens‘in transkriptomik çalışmaları: farklı şekilde düzenlenen proteinlerin tanımlanması
– Bitki kolonizasyonu boyunca transkriptom analizleri – organa özgü proteinlerin tanımlanması |
| Denitrifikasyon bakterileri / dehalojenatörler | – Biyoremediasyonda uygulama
|
– Çevresel strese yanıtın değerlendirilmesi için proteomik çalışmalar – toluen ve etilbenzen yolaklarının düzenleyici mekanizmaları
– Metabolik ve düzenleyici plaktisitenin bir sonucu olarak yola özgü alt-proteomların keşfi – Dehalojenatörlerin proteomik çalışmaları – enzim repertuarına bağlı olarak çeşitli substratların dehalojenasyonu için kapasite (indirgeyici dehalojenaz ekspresyonu) |
| Fermente bakteri ve maya | – Biyoteknolojik uygulama | – Fermantasyon süreçleri sırasında çevresel aşırılıklar altında hayatta kalma stratejilerinin daha iyi anlaşılması için proteomik çalışmalar
– LAB ve sintrofik bakterilerin (metanojen muadili ile birlikte) ve S. cerevisiae‘nin proteomik analizleri, yukarı regüle edilen genleri/yolakları göstermek için |
| Siyanobakteriler / fotosentetik bakteriler | – Biyoteknolojik uygulama | – Yaşam tarzlarını karşılaştırırken stres koşulları altında mikrobiyal davranışları aydınlatmak için proteomik çalışmalar |
3.2. Doğal mikrobiyal komunitelerin proteomik çalışmaları
3.2.1. Metaproteomiks
Canlı bir sistemin proteomu, belirli koşullar altında çalışan enzimlerini yansıttığı için proteomik çalışmalar genomik verileri geliştirmektedir. Ayrıca proteomik analizler, mikroarray uygulaması ile elde edilen gen ifade profillerini proteinlerin posttranslasyonel modifikasyonları hakkındaki bilgilerle zenginleştirmektedir. Böylece, proteomik analizler sadece genetik bilginin dizilendiği mikroorganizmalar için değil, tüm mikroorganizmalar için geçerli olabilmektedir.
Mikrobiyal doğal yaşam alanları, çevresel proteomik çalışma yaklaşımının mikrobiyal konsorsiyumların yapısını ve işlevini vurgulamaya önemli ölçüde katkıda bulunabileceği karmaşık komüniteleri temsil eder. Yani, çevredeki mikrobiyal komünitelerin bu tür küresel analizine metaproteomik denir. Metaproteomik analiz yaklaşımı, mikrobiyal komüniteleri yaşayan bir meta-organizma olarak kabul eder. Bu meta-organizmada proteomik (yani popülasyon) düzeyde kaydedilen herhangi bir fizyolojik değişiklik, çevresel değişikliklere işlevsel bir yanıt olarak yorumlanabilir. Mikrobiyal konsorsiyumları tek tek mikroplardan oluşan basit bir koleksiyondan ziyade bütün bir organizma olarak görmenin bir diğer nedeni de bu meta-organizmaların gen alışverişinde bulunma ve metabolik yeteneklerini paylaşma kabiliyetidir.
Teknik açıdan bakıldığında, metaproteomik yaklaşım, saf kültürlerin ve belirli bir mikrobiyal konsorsiyumu oluşturan tüm türlerin izolasyonu ve bakımı gibi zahmetli adımları ortadan kaldırdığı için standart biyokimyasal/moleküler biyoloji analizlerine kıyasla büyük avantaj sağlamaktadır. Ayrıca metaproteomiks, bir komünite içindeki mikroorganizmalar arasındaki çok yönlü ilişkilere ışık tutar. Bu tür bilgilerin saf kültürlerle üretilmesi mümkün değildir.
Proteomik çalışmaların saf kültürlere kıyasla daha zorlu olduğu doğrudur. Proteomik analizlere tabi tutulan komünite örnekleri, içerik ve yapı bakımından karmaşıktır ve varsayılan genleri bulmak için çalışılması gereken büyük miktarda ORF içerir. Bu muazzam sayıdaki gen ürünü, konsorsiyum temsilcilerinin çoğunluğu için genom dizileme verileri olmadığından veri işleme ve yorumlamayı oldukça zorlaştırmaktadır. Gen ürünü ek açıklamasına aracılık eden in silico analiz de metaproteomik çalışmaların başarısı için çok önemlidir.
Günümüzde, protein ekstraksiyon yöntemlerinin gelişmesi ve bunların doğrudan çevresel örneklerde (su veya toprak habitatlarından) tanımlanması, zahmetli geleneksel yaklaşımların getirdiği engellerin üstesinden gelmekte ve daha hızlı ve daha iyi sonuçları garanti etmektedir. Metagenomik çalışmalarda giderek daha fazla uygulama alanı bulan pyrosequencing yaklaşımı, bu tür modern yöntemlere iyi bir örnektir.
3.2.2. Doğal mikrobiyal komüniteler
Doğal yaşam alanlarındaki mikrobiyal komünitelerin metaproteomik çalışmaları, bu komünitelerin değerli işlevsel özelliklerinin aydınlatılmasına yardımcı olmaktadır. Toprak ve sucul (deniz) mikrobiyal komüniteler metaproteomik bir yaklaşım kullanılarak incelenmiş ve potansiyel pratik uygulama ile değerli bilgiler biriktirilmiştir.
Örneğin, yüzey suyu mikrobiyal komüniteleri başlangıçta 1D ve 2D SDS-PAGE ile incelenmiştir. Bu metodolojik yaklaşımlar, protein parmak izi oluşturma ve bazı proteinler için işlevsel karakterizasyon ile sonuçlanmıştır. Teknolojik ilerlemenin ardından, asit madeni drenajlarının mikrobiyal biyofilmlerini incelemek için shotgun tekniği araştırılmıştır. Bu yaklaşım, aynı çevresel habitattan üretilen bir dizi veri seti kullanılarak 2000’den fazla proteinin tanımlanmasıyla sonuçlanmıştır. Metaproteomik çalışmalar, komünitede baskın olduğu kanıtlanan bireysel suşların protein repertuarını tanımlamak için kullanılmıştır. Böylece, asit madeni habitatındaki zorlu çevresel koşullara başarılı mikrobiyal adaptasyona katkıda bulunan yatay gen transferi için kanıt toplanmıştır.
Toprak mikrobiyal komünitelerinin metaproteomik çalışmaları da ilerlemektedir. Metodolojik yaklaşımlardaki darboğaz adımı, karmaşık toprak ortamından doğrudan protein ekstraksiyonuna izin veren teknolojinin eksikliğidir. Güvenilir proteomik veriler elde etmek için ekstrakte edilen proteinlerin yeterli miktar ve kalitede olması gerektiği unutulmamalıdır. Bu engelleyici sorunu çözmeye çalışan bilim insanları, çözünmüş organik maddeden oluşan bir model matris üzerinde toprak proteom parmak izleri oluşturmayı başardılar. Bu yaklaşımı kullanarak, bol miktarda lakkaz ve selülaz hidrolitik enzimlerinin varlığını belirlediler. Bunların, tanımlanmış bir ekosistemde aktif mikroorganizmaların varlığının göstergesi olarak kullanılmasını önerdiler. Karmaşık çevresel matrislerin bir başka modeli, çok düşük konsantrasyonlarda (yaklaşık %6) hedef mikroorganizmaların varlığını değerlendirmek için kullanılmıştır.
Bu veriler, az bulunan türlerin bolluğunu yansıtan potansiyel biyo-tehdit unsurlarının varlığının değerlendirilmesi için tavsiye edilmektedir.
3.2.3. Mikrobiyal toplulukların işlevsel çeşitliliği proteomiks aracılığıyla görülüyor
Canlı sistemlerdeki protein rezervuarının incelenmesi giderek artan bir popülerlik kazanmaktadır. Buna bağlı olarak biyoinformatik veri girdisi de genişlemektedir. Protein yapısı ve işlevine ilişkin bu güçlü bilgi akışlarının yanı sıra, mikrobiyal komünite yapısı ve işleyişinin bir ekosistemle doğrudan ilişkisi ve bireysel protein profillerinin tahmini zordur. Bir ekosistemdeki protein çeşitliliğinin işlevsel önemini ortaya çıkarmak için, 1) protein çeşitliliği karakterize edilmeli ve 2) proteomik komünite analiz edilmelidir. Bu amaçla, deneysel verileri belirli bir istatistiksel modelle eşleştiren kontrollü koşullar altında model sistemler kullanılır. Model sistemlerde protein tanımlama ve göreceli kantitatif bolluk bu yaklaşımın zorunlu ilk adımıdır. Bir ekosistemdeki protein çeşitliliğinin tamamını ve mutlak miktarını belirlemek mümkün değildir. Veriler, hem pro- hem de ökaryotları içeren proteom komünitelerinde 1 x 104 – 109, hatta 10(10)gibi rakamları tahmin etmektedir. Biyoçeşitlilik verileri ve çevresel proteomik verileri arasında indeks örnekleme prosedürü, ham analitik veriler ve referans veriler aracılığıyla karşılaştırıldığında dikkate değer bir uyum olduğundan, biyoçeşitlilik veri analizleri için yaygın olarak uygulanan istatistiksel yaklaşımlar çevresel proteomik verilerine de uygulanabilir. Bu karşılıklı analitik yaklaşım, proteomik çeşitlilik modellerinin daha fazla keşfedilmesine ve işlevsel önemlerinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır.
Benndorf ve arkadaşları (2007), belirli bir mikrobiyal topluluğun işlevsel yönlerini ortaya çıkarmaya yönelik yeraltı suyu ve toprağın metaproteomik analizi için bir protokol oluşturmuştur.
4. ÇEVRESEL PROTEOMİK ARAŞTIRMA VE UYGULAMA
4.1. Metabolik mühendisliği
Metabolik mühendisliği, bir konak organizmanın metabolik özelliklerinin manipülasyonu yoluyla arzu edilen ürünlerin üretilmesiyle ilgilenen multidisipliner bir bilim dalıdır. Etkili protein tasarımının temel bir unsuru olan metabolik mühendisliği, yüksek verimlilikte katma değerli protein biyosentezine katkıda bulunur. Hücre üreticileri içindeki genetik ve düzenleyici süreçlerin optimizasyonu yoluyla hedeflenen ürünlerin tasarımı ve üretimindeki büyük avantajının yanı sıra, metabolik mühendisliği, pratik uygulamasının altında yatan bazı engellerle karşı karşıyadır. Örneğin, hücre dışı protein üretimiyle birlikte konak hücre, diğer hücresel süreçleri, özellikle de diğer konak hücre proteinlerinin üretimini etkileyen fizyolojik değişimlere uğrar. Proteomik analizler, süreç proteinler veya protein kompleksleri tarafından katalize edildiğinden ve/veya düzenlendiğinden ve bunların üretimindeki değişiklikler eksojen genlerin ifadesi boyunca tahmin edilebildiğinden, heterolog gen ifadesine karşı konak hücre tepkisinin aydınlatılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Proteomik analiz, metabolik mühendisliği sırasında bu temel eylem modeline dayanan hücre içi enzimlerin heterolog ifadesi sırasında değerli veriler sağlar. Örnek olarak glutatyon S-transferaz ve epoksit hidrolazın (hücresel enzimatik antioksidan savunma sisteminin temel bileşenleri) ifadesi verilebilir. Lee ve arkadaşları (2006), kantitatif proteomik yaklaşımıyla, bu metabolik mühendisliği stratejisinin uygulanmasının piruvat metabolizması, glutatyon sentezi ve antioksidan savunma enzimlerinin indüklenmesine ve glukoneogenez, TAC, indol sentezi ve yağ asitleri sentezi enzimlerinin baskılanmasına yol açtığını bulmuştur.
Bağırsak mikrobu Escherichia coli, toprak ve su ortamlarına özgü olmamasına rağmen, klasik bir metabolik mühendisliği konağı olarak kullanılmış ve çevresel proteomik araçları ile kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. Burkholderia cepacia G4 suşunun altı geninin eklenmesiyle trikloroetenin biyolojik olarak parçalanması için metabolik olarak tasarlanmış E. coli suşunun proteom çalışmasına dayanan ekolojik bir bağlamda E. coli davranışının analizleri, genlerin eklenmesi nedeniyle metabolik olarak değiştirilmiş konakçı suşun fizyolojisinin değiştiğini göstermiştir.
4.2. Mikrobiyal ekoloji
Geleneksel ekolojik çalışmalar, bakterilerin çevrelerine doğal olarak meydana gelen adaptasyonlarını araştırmaktadır. Çevresel proteomiks, özellikle aşırı çevresel koşullar altında (örneğin hipertermofilik olanlar) adaptasyon mekanizmalarına ilişkin içgörü sağlaması nedeniyle bu çalışmalara katkıda bulunur. Bu nedenle, hipertermofillerin proteinleri, gelişmiş konformasyonel kararlılıkları ve yüksek sıcaklıkta çalışabilirlikleri nedeniyle araştırmaya odaklanmaktadır. Bu olgunun incelenmesi protein katlanmasının moleküler mekanizmalarına ışık tutmaktadır. Prosinechki ve arkadaşları (2006), 70 -97oC termal aralıkta gelişebilen g. Sulfurispharea‘ya ait hipertermofilik arkeon üzerinde çalışmışlardır. Dinamik proteom pertürbasyon tekniğini kullanarak, detoksifikasyon, nükleik asit işleme, enerji metabolizması gibi temel hücresel süreçlerde yer alan daha yüksek stabiliteye sahip proteinleri belirlemişlerdir.
Diğer sıcaklık etkisinin incelendiği, soğukla ilgili çalışmalar da mikrobiyal adaptasyon mekanizmasının ortaya çıkarılmasına katkıda bulunmuştur. Qiu ve arkadaşları (2006) proteomik analiz uygulayarak Sibirya permafrost sedimentinden izole edilen bir Exiguobacterium türünün düşük sıcaklıklara adaptasyonunu incelemiştir. Kromatofokuslama ve MS’i birleştiren yazarlar, 4 oC’de benzersiz veya tercihli olarak ifade edilen 250’den fazla protein tanımlamıştır. Bireysel hücresel protein düzenlemesi yoluyla fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini içeren bir soğuk adaptasyon hücresel stratejisine işaret eden soğuk iklimlendirme ve soğuk şok proteinlerini tanımlamışlardır. Düşük sıcaklıklarda yukarı doğru düzenlenen proteinlerin, hücrelerin sıfıra yakın veya sıfırın altındaki sıcaklıklara uyum sağlamasına olanak tanıdığı tahmin edilebilir. Proteomik çalışmalar, bakteriyel soğuk adaptasyonu hakkındaki hipotezin kanıtlanmasına katkıda bulunabilir. Hücrenin tüm protein topluluğu ve işleyişi hakkında bilgi sağlamak için kapsamlı proteomik çalışmalara ihtiyaç vardır. Belirli bir işlevsel bağlamda incelenen küçük protein kümeleri büyük resmi oluşturmaz. Bu gerçek, Colwellia psychrerythraea ile yapılan ve hücre zarı akışkanlığı kriyotolerans bileşiklerinin sentezi ve alımındaki değişikliklerin ve C alımına yönelik sıcaklığa bağlı engellerin üstesinden gelme stratejilerinin kanıtlandığı bir başka çalışma ile kanıtlanmıştır.
İki farklı abiyotik stres faktörünün – tuz ve soğuk – birleştirici etkisi Psychrobacter sp. de kanıtlanmıştır (Zheng ve diğerleri, 2006). Tuz varlığında soğuk adaptasyonunda çeşitli proteinler tanımlanmıştır, bu da tuz ve soğuğun protein ifadesi üzerindeki kombinasyon etkisini göstermektedir.
4.3. Çevresel stres toleransı
Proteomiğin genomik dizileme olmadan protein tanımlamasına sağladığı büyük avantaj, bu moleküler yaklaşımı çevresel abiyotik stres koşullarına verilen fizyolojik tepkiler hakkında bilgi edinmek için çok yönlü bir araç haline getirmektedir. Proteomiklerin kendi doğal ortamlarındaki mikroorganizmalar için sistem çapında bilgi sunma kabiliyeti, mikropların termal, kimyasal, oksidatif ve diğer streslere yanıt değerlendirmesinde uygulanmasını teşvik etmektedir. 2D SDS PAGE ve kromatografi tabanlı proteomik çalışmalar, düşük ve yüksek sıcaklık, düşük pH, ağır metaller ve oksidatif stres toleransı mekanizmalarını incelemek için en çok araştırılan iki yöntemdir. Bu çalışmalar, iyi bilinen stres yanıt proteinlerinin ve lipid biyosentetik yolları, ozmoprotektan birikimi, yeni taşıyıcı proteinler gibi diğer adaptasyon/detoksifikasyon faaliyetlerinde yer alan kayıtlı proteinlerin yukarı regülasyonunu kanıtlamıştır.
Buna ek olarak, bir türün farklı streslere maruz kalması durumunda stres tepkisi düzenlemesinin farklılaşabileceği anlaşılmıştır. Bu gözlemin tipik bir örneği, yüksek tuz konsantrasyonlarına, nitrat stresine ve yüksek sıcaklıklara maruz kalan Desulfovibrio vulgaris‘tir. Proteomik analizler, farklı stres koşulları altında yukarı ve aşağı regüle edilen protein/protein sistemleri modellerini göstermiştir. D. vulgaris‘in NaCl ve KCl streslerine benzer şekilde yanıt verdiği bulunmuştur. Bununla birlikte, nitrat stresine ve yüksek sıcaklıklara farklı tepki verirler. Ayrıca, proteomik çalışması proteinlerin şaperonlarının posttranslasyonel modifikasyonunu tahmin etmektedir. Tüm bu veriler, proteomik analizin sistem genelindeki stres tepkilerini ortaya çıkardığını göstermektedir. Ayrıca bu yaklaşım, her bir stres koşuluna atfedilen spesifik savunma mekanizmalarını da ortaya koymaktadır.
5. ÇEVRESEL PROTEOMİK POTANSİYELİ
5.1. Metodolojik ve teknik yenilikler
Çeyrek asırlık geçmişi içinde proteomik, tek tek proteinlerin biyokimyasal analizinden, canlı sistemlerin gelişiminin herhangi bir aşamasında ifade kalıpları, yapı, lokalizasyon, etkileşimler ve modifikasyonlar gibi birçok farklı protein özelliğini eşleştirmek için bir tekniğe dönüşmüştür. Proteomiğin amacı, organizmanın proteom dinamiğini gelişimi boyunca incelemektir.
Teknolojik açıdan bakıldığında, proteomik bilimsel hedefine ulaşmak için son teknolojik gelişmelere dayanmaktadır. Geçen yüzyılın sonlarında 90’larda 2D elektroforezin geliştirilmesi, ilk kez bütün bir proteomun haritalanmasına olanak sağlamıştır. Daha sonra, protein dizileme teknolojileri proteomiğin gelişimini artırmış ve protein tanımlama ve karakterizasyonunda tam kapasitesinin ortaya çıkmasına yardımcı olmuştur. Kütle spektrometresinin (MS) sunduğu yüksek analiz hassasiyeti ve tamamlayıcı gaz fazı teknolojileriyle (örn. iyon hareketliliği spektrometrisi) birleşmesi, MS’i proteomik analizde temel analitik metodoloji haline getirmiştir.
Protein ekstraksiyonu ve türevlendirme yöntemleri ile yukarıda bahsedilen ayırma yaklaşımları, araştırmacıların karmaşık protein karışımlarını elementlerine ayırma becerisine katkıda bulunur.
Son olarak, araştırmanın deneysel aşamaları boyunca biriken büyük miktarda ham proteomik verinin işlenmesi ve yorumlanması, biyolojik işlevler ve bunların canlı sistemlerdeki düzenlemeleri hakkında daha derin bilgiler edinilmesini kolaylaştıran ve sürekli olarak geliştirilen biyoinformatik analiz yöntemleri ile desteklenmektedir. Matematik, biyoistatistik ve bilgisayarın entegre bir dalı olan biyoinformatik, genomik ve proteomik çalışmaların biyo-verilerini sofistike araçlarla analiz ederek deneysel sonuçların açıklanmasına ve yorumlanmasına yardımcı olur. Ayrıca bu metodolojik yaklaşım, ilgilenilen proteinlerle etkileşime girebilecek molekül tasarımına ve protein-protein etkileşimi tahminine yardımcı olmaktadır. Bu nedenle biyoinformatik, birincil proteomik verilerin bilgiye dönüştürülmesi ve uygulanması için gereklidir.
Ancak, bu teknolojik ilerlemelerin yanı sıra, proteomik metodolojisinin evrensel uygulamasını engelleyen sınırlamaları vardır. Örneğin, konsantrasyon aralıklarının oldukça geniş olması ve konsantrasyonu çok düşük olan proteinlerin amplifikasyonu için uygun metodolojinin bulunmaması nedeniyle bir numunede sunulan toplam protein havuzu için veri elde etmek hala imkansızdır.
Tablo 3.2, başlıca proteomik metodoloji gruplarının son teknolojik gelişmelerini, avantajlarına, performanstaki darboğaz adımlarına ve teknolojideki yeni gelişmelere vurgu yaparak sunmaktadır. Şekil 3.1’deki grafik, bu metodolojik yaklaşımların bir proteomik iş akışında nasıl organize edildiğini özetlemektedir.
Tablo 3.2. Başlıca proteomik metodoloji gruplarının son teknolojik gelişmelerinin özeti.
| Yöntem | Avantajlar | Performansta tıkanma adımları | Yeni gelişmeler |
|
Bireysel yöntemler |
|||
| 2D poliakrilamid jel elektroforezi (2D-PAGE) – proteinlerin kütle ve yüklerine (izoelektrik noktaları göre ayrılması için yöntem | – Yüksek verimlilik: bir jelde binlerce ayrı proteinin ayrılması;
– Yüksek çözünürlük: Jel başına 10000 protein noktası; – İyi bilinen boyalarla (Coomassie mavisi, koyu mor, gümüş, vb.) protein görselleştirme. |
– Zaman alıcı süreç
– Yoğun emek gerektiren teknikler – Jelden jele varyasyonlar; – Alkali ve hidrofobik proteinler içindeki doğal sınırlamalar. |
– Floresan bazlı fark jel elektroforezinin kullanımı;
– Daha iyi tekrarlanabilirlik ve daha yüksek çözünürlük için 2D-PAGE’in MS ile birleştirilmesi. |
| Sıvı kromatografisi (LC) – karmaşık bir bileşiklerin nicel olarak ayrılması ve tanımlanması için bir yöntem | – Büyük ve kırılgan biyomolekülleri analiz etme kabiliyeti;
– Karmaşık karışımlardaki peptit ve proteinlerin analizi için MS ile birleştirme yeteneği; – 2D LC – çok boyutlu protein tanımlaması için peptitleri ayırır. |
– Numunelerin ön işleme tabi tutulması ihtiyacı | – LC ve MS’in birleştirilmesi. Aşağıdan yukarıya LC-MS yaklaşımının uygulanması: peptitlerin LC-MS öncesi sindirimi için proteazların kullanımı ve LC-MS sonrası peptit kütle parmak izi bireysel protein dizileri elde etmek için |
| İzotop kodlu afinite etiketi etiketleme (ICAT-etiketleme) – iç olarak etiketlenmiş peptitlere dayalı peptitlerin göreceli miktar tayini için bir yöntem | – Yüksek doğruluk: stabil izotop seyreltme yöntemi uygulaması
– 2D PAGE ile uyumlu |
– CYS içeren proteinlerin mevcudiyetini gerektirir
– Göreceli peptit miktar tayini sunar – Daha yüksek performanslı araçlara ihtiyaç var |
– Geliştirilmiş IACT-etiketleme versiyonu – göreceli ve mutlak kantifikasyon için izobarik etiketler (iTRAQ), bir örnekte dört proteine kadar eşzamanlı kantifikasyona ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına, geniş proteom kapsamına ve gelişmiş hassasiyete olanak tanır |
| Kütle spektrometresi (MS) – kütle-yük (m/z) oranı yaklaşımına ve farklı iyonizasyon yöntemlerinin kullanımına dayalı olarak protein tanımlaması için uyarlanmış kütle belirleme tekniği: | – MS – proteomikteki en güçlü platform
– MS – üst protein tanımlamasına uyarlanabilir |
– Bir peptit kütle parmak izi sağlar; tek peptitlerin izolasyonu ve bunların N veya C-terminal parçalarına daha fazla ayrışması yoluyla spesifik sekans bilgisi sunar. | |
| – ESI – elektro-sprey iyonizasyonu;
– MALDI – matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon – SELDI – yüzey geliştirilmiş lazer desorpsiyon / |
– ESI: LC kolonlarının ve MS cihazının uyumluluğu sayesinde otomasyonu kolaylaştırdı
– MALDI: proteinleri femtomol miktarlarında analiz eder; bazı safsızlıkları tolere eder; bilgileri otomatik olarak bir veritabanı aramasına aktarır – SELDI: LC ayırma işleminden sonra yüksek çözünürlüklü kütle spektrumu ve kromatografik çip yüzeylerinde tutulan proteinlerin/peptitlerin mikro miktarlarının kısmi karakterizasyonunu sağlar |
– SELDI: protein-protein etkileşimlerinin gerçekleşebilmesi için proteinlerin dizi immobilizasyonu süreci boyunca uygun bir konformasyonda katlanması gerekir |
– ESI: hızlı protein keşfine ve bunların diferansiyel ifadelerinin analizine olanak sağlar
– MALDI: in situ enzimatik olarak sindirilmiş doku görüntülerinin doğrudan analizini sunar |
| Faj görüntüleme – viral yüzeyler üzerinde peptit/protein kütüphaneleri oluşturma ve bunları aktivite açısından tarama | – Proteinler kendilerine karşılık gelen genlerle ilişkili kalır ve tanımlanabilir
– Ligandlar üretmek ve hastalıkla ilgili hedefleri belirlemek için in vitro / hayvan modellerini kullandı. |
||
| Proteinler içindeki daha büyük alanlara bağlanan ligand (peptid) hedeflerinin klonlanması | – Yeni alanların/proteinlerin keşfi için uygulanır | ||
|
Birleştirilmiş metodoloji yaklaşımları |
|||
| – LC-FD (florojenik türevlendirme) – protein tespiti ve miktar tayini için bir yöntem | – Yüksek tekrarlanabilirlik
– Prosedürlerin basitliği – Diferansiyel proteomik analizi |
– Doğrudan MS’e bağlanan Nano-LC-FD-LC sistemleri | |
| – PTM analizleri için LC-MS ve MALDI-TOF MS – protein post-translasyonel modifikasyonlarının (PTM’ tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir yöntem | – Özellikle PTMS ile ifade edilen proteinlerin analizi için uygulanabilir: glikozilasyon, fosforilasyon ve alkilasyon | – Grafitik karbon kolonların uygulanması
– LC-MS veri setlerinin glikoproteomik karakterizasyon ve kantitasyon için kullanımı |
|
| – MS-amenable peptitlerin LC-MS’i – temel hücresel fonksiyonlarla ilişkili proteinlere yönelik hedef odaklı analizler | – Yüksek algılama hassasiyeti
– Hassas miktar belirleme
|
– Homolog protein setlerini toplayan ve hedeflenen analiz için en temsili ve sürece özgü peptitleri seçen bir biyoinformatik boru hattının düzenlenmesi | |
| – Monolitik LC/MS – proteinlerin tanımlanması ve proteolitik sindirimlerin karakterizasyonu için bir yöntem | – Hızlı bir yöntem
– Sistem kullanımını basitleştiren kapiler veya nano boyutlu kolonlar için yüksek akış hızları |
– Membran proteinlerinin tespiti ve analizi için başarılı uygulama(25 ) | |
| – MS-İyon Hareketliliği – tersiyer ve kuaterner protein yapılarının ve yapısal tanımlanması | – Protein yapısı ve etkileşimlerinin moleküler modellemesi için değerli yapısal bilgilerin sağlanması | ||
Şekil 3.1. Proteomik teknolojileri iş akışının şematik sunumu. Kaynak: Cho, 2007.
5.2. Bir bakışta deneysel çevresel proteomik
Çevresel proteomiks, proteinlerin bir ekosistemde veya en azından bir tür topluluğunda nasıl etkileşime girdiğine dair bilgilerimizi genişletebilir. Bu etkileşimin mekanizmalarını anlamak, ekolojik süreçlerin performansına ışık tutacaktır. Bir ekosistemdeki proteinlerin işlevsel önemini anlamak için, proteinleri biyokimyasal özelliklerine, hücre altı lokalizasyonlarına ve katıldıkları biyoproseslere göre gruplandıran bir yaklaşım makul ve bilgilendirici görünmektedir. Proteinleri işlevsel kategorilerde sınıflandıran gen ontolojisi veri tabanları bu bağlamda iyi bir seçenektir ve proteomik, benzer ortamlarda yaşayan (mikro)organizmalar tarafından üretilen işlevsel olarak eşdeğer proteinler hakkında bilgi sağladığından yeni ekolojik içgörülerin oluşturulmasına katkıda bulunabilir. Bu nedenle, bir komünitedeki tüm protein havuzunu karakterize etmek yerine, çevresel koşullara bir yanıt olarak niceliklerini değiştirmek için tanımlanan daha az sayıda proteine odaklanmak daha iyidir. Deneysel olarak, bir ekolog bir topluluğa bir tür ekleyip çıkarabilir ve hangisinin belirli bir çevresel faktöre yanıt vermekten sorumlu olduğunu bulabilir. Bir topluluğun moleküler fenotiplemesi olarak adlandırılan bu yaklaşım, proteinlerin nasıl işlediği ve zamansal bir perspektifte dinamikleri hakkındaki bilgilerimize katkıda bulunmaktadır. Bu, ekolojistlerin hangi proteinlerin ekosistemde önemli bir rol oynadığını tahmin etmelerine yardımcı olacaktır.
Ayrıca, in vitro protein sentezlemedeki deneysel çıktılar, ekolojistlere besin ağlarının modelleri olarak belirli deneysel mezokozmosların tasarımında ve çeşitli çevresel koşullar altında içlerindeki protein kaderini takip etmede veya ekosistemleri potansiyel olarak gerekli proteinler ve metabolitlerle zenginleştirmede ve besin ağı tepkilerini ölçmede yardımcı olacaktır. Böylece, ekolojik proteom ölçümü ve bir ekosisteme türler eklendiğinde veya çıkarıldığında ya da yapay olarak sentezlenmiş proteinler eklendiğinde biyoçeşitlilik tepkisinin ölçülmesi, proteinlerin ekosistem organizasyonundaki işlevleri hakkında derinlemesine bilgi sağlayacaktır.
6. ZORLUKLAR, SINIRLAR VE PERSPEKTİFLER
Proteomik, mikrobiyoloji, mikrobiyal ekoloji ve çevresel biyoteknoloji çalışmalarını daha da genişletme potansiyeline sahip güçlü bir omik daldır. Şu anda mikroorganizmalarla yapılan çevresel proteomik çalışmalarının çoğu laboratuvar tabanlıdır. Bununla birlikte, ilk metaproteomik araştırmalar, proteomiklerin mikrobiyal konsorsiyumlar içinde proteinlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna katkıda bulunma kabiliyetine, dizileme verilerinin veya filojenik özelliklerin eksikliğine ışık tutmaktadır. Çevresel proteomiklerin gelişimini tehdit eden en temel zorluklardan biri, farklı ortamlardaki (toprak, su) mikrobiyal komünitelerden protein ekstraksiyon yöntemlerinin geliştirilmesi gerekliliğidir. Ayrıca, biyoinformatik bilimi ve araçlarındaki ilerlemenin de metaproteomik ham verilerden peptit ve proteinleri daha iyi tanımlaması beklenmektedir.
Proteinler hücresel yapıyı sağlar, enerji üretir, iletişimi destekler ve üremeyi mümkün kılar. Böylece canlı hücrenin yapısal ve işlevsel ağlarını sağlarlar. Genetik bilgi statikken, hücrenin protein bileşeni dinamiktir. Proteinlerin nükleik asitlere (DNA ve RNA) kıyasla çok daha karmaşık ve üzerinde çalışılması zor olduğu iyi bilinmektedir. Bu zorluk, peptitler/proteinler üzerine araştırmaları tetiklemiş ve proteomiks ile ilgili perspektifleri şekillendirmiştir:
- Protein fiziksel/kimyasal özellikleri. Analiz sırasında dikkat edilmesi ve korunması gereken ikincil ve üçüncül yapılar; dikkate alınması gereken denatürasyon süreci ve ilgili potansiyel denatürasyon faktörleri: enzimler, sıcaklık, ışınlama, mekanik kuvvetler, vb; çözülmesi gereken protein çözünürlüğü ile ilgili problemler.
- Protein miktar tayini. Proteinlerin DNA gibi çoğaltılamayacağı ve bol olmadıklarında tespit edilemeyecekleri konusunda endişelenmek gerekir. Thulasiraman ve arkadaşları (2005) tarafından yakın zamanda geliştirilen teknoloji, küçük konsantrasyonlarda birçok proteine erişim sağlayan ve klasik analitik tekniklerle pratik olarak tespit edilemeyen ligand kütüphane boncuklarını araştırmaktadır. Bu yaklaşım, proteinlerin spesifik afinite ligandları üzerindeki konsantrasyonlarının izlenmesine yol açmaktadır.
- Mikroarray ve protein hassasiyeti. Nettikadan ve arkadaşları (2006), küçük hacimler ve protein miktarları ile sorununun üstesinden gelmeye yardımcı olan yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet sunan ultramikro-dizileri tasarlamak için mikro-dizi ve küçük örnek hacimlerinin taranmasını birleştiren bir teknik önermiştir.Bu stratejik yaklaşım, sınırlı protein miktarlarıyla başa çıkmak için güvenilir teknikler sağlamaktadır.
- Multiomik entegrasyon. Proteomiklerin genomik ve metabolomiklerle entegrasyonu hala zorlu bir süreçtir ancak proteinlerin fonksiyonel çeşitliliğini ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Böylece proteomik, biyomedikal araştırmaların yararına fonksiyonel genomiklerin geliştirilmesine katkıda bulunur ve teşhis ve tedavi için yenilikçi ürünlerin geliştirilmesini etkiler.
7. KAYNAKLAR
Andersson, T., et al. (2007). Automating MALDI sample plate loading. J. Proteome Res. 6: 894-896.
Benndorf, D., Balcke, G.U., Harms, H., et al. (2007). Functional metaproteome analysis of protein extracts from contaminated soil and groundwater. ISMEJ 1:224–34.
Biddle, J.F., Fitz-Gibbon, S., Schuster, S.C., et al. (2008). Metagenomic signatures of the Peru Margin subseafloor biosphere show a genetically distinct environment. Proc Natl Acad Sci USA 105:10583–8.
Bogan, M.J. and Agnes, G.R. (2004). Wall-less sample preparation of microm-sized sample spots for femtomole detection limits of proteins from liquid-based UV-MALDI matrices. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15: 486-495.
Cho, W.C.S. (2007). Proteomics Technologies and Challenges. Geno. Prot. Bioinfo. Vol. 5 No. 2 2007 77-85
Cho, W.C. and Cheng, C.H. (2007). Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev. Proteomics 4: 401-410.
Dopson, M., Baker-Austin, C., Bond, P.L. (2004). First use of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis to determine phylogenetic relationships. J Microbiol.Methods 58:297–302.
Dworzanski, J.P., Snyder, A.P. (2005), Classification and identification of bacteria using mass spectrometry-based proteomics. Exp Rev Proteomics 2:863–78.
Gulmann, C., et al. (2006). Array-based proteomics: mapping of protein circuitries for diagnostics, prognostics, and therapy guidance in cancer. J. Pathol. 208: 595-606.
Hecker, M., Volker, U. (2004). Towards a comprehensive understanding of Bacillus subtilis cell physiology by physiological proteomics. Proteomics 4:3727–50.
Kim, W.K., et al. (2006). The many faces of protein protein interactions: a compendium of interface geometry. PLoS Comput. Biol. 2: e124
Lauber, W.M., et al. 2001. Mass spectrometry compatibility of two-dimensional gel protein stains. Electrophoresis 22: 906-918.
Lee, J., Cao, L., Ow, S.Y., et al. (2006). Proteome changes after metabolic engineering to enhance aerobic mineralization of cis-1,2-dichloroethylene. J ProteomeRes 5:1388–97.
McCormack, A.L., et al. (1997). Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level. Anal. Chem. 69: 767-776.
Methe,´ B.A., Nelson, K.E., Deming, J.W. (2005). The psychrophilic lifestyle as revealed by the genome sequence of Colwellia psychrerythraea 34H through genomic and proteomic analyses. ProcNatl Acad SciUSA 102:10913–8.
Nettikadan, S., et al. (2006). Detection and quantification of protein biomarkers from fewer than 10 cells. Mol. Cell. Proteomics 5: 895-901.
O’Farrell, P. H. (1975). High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007–4021. doi:10.1016/S0021-9258(19)41496-8
Prosinecki, V., Botelho, H.M., Francese, S. (2006). A proteomic approach toward the selection of proteins with enhanced intrinsic conformational stability. J Proteome Res 5: 2720–2726.
Qiu, Y.H., Kathariou, S., Lubman, D.M. (2006). Proteomic analysis of cold adaptation in a Siberian permafrost bacterium – Exiguobacterium sibiricum 255-15 by two-dimensional liquid separation coupled with mass spectrometry. Proteomics 6:5221–33.
Ram, R.J., VerBerkmoes, N.C., Thelen, M.P., et al. (2005). Community proteomics of a natural microbial biofilm. Science 308: 1915–20.
Reardon, K.F. (2009). Environmental proteomics: Applications of proteome profiling in environmental microbiology and biotechnology Briefings in Functional Genomics and Proteomics 8:1. 75-87 doi:10.1093/bfgp/elp005
Shevchenko, A., Sunyaev, S., Loboda, A., et al. (2001). Charting the proteomes of organisms with unsequenced genomes by MALDI-quadrupole time of flight mass spectrometry and BLAST homology searching. Anal Chem;73: 1917–26.
Schulze, W.X., Gleixner, G., Kaiser, K., et al. (2005). A proteomic fingerprint of dissolved organic carbon and of soil particles. Oecologia 142:335–343.
Schweder, T., Markert, S., Hecker, M. (2008). Proteomics of marine bacteria. Electrophoresis 29:2603–16.
Thulasiraman, V., et al. (2005). Reduction of the concentration difference of proteins in biological liquids using a library of combinatorial ligands. Electrophoresis 26: 3561-3571.
Torsvik, V., Ovreas, L., Thingstad, T.F. (2002). Prokaryotic diversity – magnitude, dynamics, and controlling factors. Science 296:1064–6.
VerBerkmoes, N.C., Hervey, W.J., Shah, M., et al. (2005). Evaluation of ‘‘Shotgun’’ proteomics for identification of biological threat agents in complex environmental matrixes: Experimental simulations. Anal Chem 77:923–932.
Wilkins, M.R., Sanchez, J.-C., Gooley, A.A., Appel, R.D., Humphery-Smith, I., Hochstrasser, D.F., et al. (1996). Progress with Proteome Projects: Why All Proteins Expressed by a Genome Should Be Identified and How to Do it. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 13, 19–50. doi:10.1080/02648725.1996.10647923
Zheng, S.P., Ponder, M.A., Shih, J.Y. (2007). A proteomic analysis of Psychrobacterarticus 273-4 adaptation to low temperature and salinity using a 2-D liquid mapping approach. Electrophoresis 28:467–488.
Zieske, L.R. (2006). A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. J. Exp. Bot. 57: 1501-1508.
