Modulo 3 – Proteómica ambiental avanzada

1. INTRODUCCIÓN

El equivalente proteínico de la genómica se denomina proteómica. El término proteómica fue definido por primera vez en 1996 por Wilkins et al. para describir todo el contenido proteico de una célula, tejido u organismo mediante un enfoque sistemático. La proteómica, como rama de la biología molecular, ha centrado la atención de los investigadores, ya que ofrece una visión general de las proteínas de los sistemas biológicos. La proteómica comprende un conjunto de tecnologías que permiten la identificación y determinación cuantitativa de las proteínas expresadas en la célula. Estas técnicas permiten conocer la estructura tridimensional de las proteínas y sus modos de interacción. Dado que las interacciones proteína-proteína son los fundamentos de la transducción de señales en diversos eventos reguladores, clasificar sistemáticamente estas interacciones puede contribuir a comprender el modelado de los complejos proteicos y los principios de su reconocimiento a nivel molecular.

La proteómica, combinada con el resto de tecnologías ómicas, también contribuye al descubrimiento de los mecanismos de procesos celulares esenciales (en el contexto de la fisiología, el metabolismo y la ecología) y al fomento de las aplicaciones prácticas de estos hallazgos en los campos de la biomedicina, los estudios clínicos, la microbiología ambiental, la ecología microbiana y la biotecnología ambiental.

La proteómica ayuda a predecir el producto de un gen a partir de su secuencia de ADN, lo que facilita la ampliación de las herramientas técnicas de la biología molecular y complementa los planteamientos basados en los ácidos nucleicos en genómica. La proteómica puede aprovecharse para realizar estudios filogenéticos microbianos y clasificaciones utilizando mapas 2D de secuencias proteínicas obtenidas mediante análisis de EM.

La proteómica ambiental es una de las áreas de aplicación de la proteómica más prometedoras para estudiar los efectos de los entornos de crecimiento sobre el desarrollo de los organismos en condiciones naturales no controladas. Aunque esta rama de la proteómica está relativamente menos desarrollada que otras aplicaciones, es una herramienta indispensable que utiliza la química de proteínas para resolver oscuridades medioambientales.

La proteómica ambiental se enfrenta a graves problemas de rendimiento e interpretación de datos. Actúa en un entorno no controlado y sin condiciones de laboratorio estandarizadas. La proteómica ambiental aborda cuestiones relacionadas con organismos no cultivables cuyos genomas no están secuenciados. Además, la extracción de proteínas de muestras del suelo o acuáticas es otro reto cuya superación es un requisito previo esencial para los estudios proteómicos.

La proteómica ambiental estudia sobre todo la fisiología, el metabolismo y la ecología microbiana en entornos naturales. Se trata de hábitats poblados por poblaciones densas y multifacéticas. La mayoría de las especies microbianas de los entornos naturales no se pueden cultivar, y su fisiología e interacción son prácticamente desconocidas. Sin embargo, su potencial bioquímico en forma de capacidades metabólicas específicas (por ejemplo, metanogénesis, desnitrificación, deshalogenación, reducción de sulfatos, etc.) está atrayendo la atención de investigadores y profesionales de la biotecnología como posibles participantes en actividades de biotecnología medioambiental. Por otra parte, las capacidades de algunas especies para utilizar diversos donantes y aceptores de electrones, tolerar sustancias tóxicas y radiaciones o sobrevivir en condiciones ambientales extremas (por ejemplo, desecación, inanición, procesos de congelación/descongelación, etc.) revisten especial interés. La proteómica ambiental permite comprender a nivel molecular fenómenos como la sintrofia, el intercambio de genes y la comunicación célula a célula gracias a su potencial para operar en comunidades microbianas, la forma en que las poblaciones microbianas funcionan de forma natural.

La proteómica ambiental es una potente estrategia y enfoque metodológico para revelar todo el potencial microbiano en estas direcciones, estudiando los perfiles de expresión proteica en diferentes condiciones ecológicas. Las técnicas de alto rendimiento para la separación de proteínas (como 2D PAGE, LC, etiquetado de afinidad con código isotópico (ICAT)), desarrolladas durante la última década junto con el avance de las técnicas para el análisis de proteínas (como la EM y la búsqueda en bases de datos) mejoraron y facilitaron los procedimientos de identificación de proteínas de forma rápida y fiable.

Los avances en bioinformática también contribuyen significativamente a la identificación de proteínas a partir de organismos no cultivables. Las estrategias para aplicar la identificación de proteínas entre especies y la búsqueda de similitudes entre secuencias proteicas ayudan a identificar proteínas sin disponer de secuencias genómicas relevantes.

2. LA DIVERSIDAD PROTEICA DE LOS ECOSISTEMAS Y LAS COMUNIDADES

El avance tecnológico en la explotación de métodos de caracterización de proteínas de organismos no cultivables (la llamada metaproteómica) abrió las perspectivas de catalogación de las proteínas, constituyendo así dos subramas de la proteómica que revelan la abundancia y diversidad de las proteínas:

La proteómica comunitaria: catalogación de las proteínas de las especies componentes de ensamblajes;
La proteómica ambiental: catalogación de las proteínas de las partes del ecosistema, aun careciendo del conocimiento sobre los organismos que producen esas proteínas.

Los primeros estudios de este tipo se centraron en conjuntos relativamente poco complejos, compuestos principalmente por microorganismos que habitaban hábitats extremos, como la microflora foliar o la microflora de algunas muestras de agua de mar y suelo. Los resultados de estos estudios son de crucial importancia para el avance de la proteómica ambiental. Dan forma a perfiles diferenciales de producción y expresión de proteínas que reflejan las respuestas fisiológicas y metabólicas del organismo a las fluctuaciones de las condiciones ecológicas. Esas fluctuaciones (tanto in norma como en situaciones de estrés, incluido el cambio climático) provocan cambios en la composición y abundancia de proteínas, que, aunque se analizan mejor en poblaciones microbianas, podrían arrojar luz sobre los cambios en los flujos globales de materia y energía dentro de los ecosistemas o entre ellos.

Además de estos hallazgos esenciales, aún no está claro si los resultados de los ensamblajes microbianos pueden extrapolarse a otros más complejos por el número y variedad de elementos de los ecosistemas terrestres y acuáticos. Por ejemplo, los ensamblajes microbianos carecen de los componentes de las complejas redes alimentarias que comprenden procariotas y eucariotas multicelulares interactuantes (los llamados eucariotas macrobianos). Por otra parte, los sistemas macrobianos se enfrentan a retos técnicos que hay que superar, en particular:

Identificación de proteínas a partir de especies cuyos genomas no están secuenciados;
Diferencias entre la conformación física y biológica de las proteínas;
Diferencias entre las actividades de las proteínas nativas y las aisladas;
Dificultades técnicas a la hora de extraer proteínas de matrices complejas (véase el agua o el suelo) con la suficiente fiabilidad para ajustarse al objetivo de la investigación.

Sin embargo, las técnicas de alto rendimiento y los enfoques bioinformáticos responden a estos retos, generando información valiosa a nivel proteínico, el nivel más directo de medición de los patrones moleculares del fenotipo del ecosistema microbio-macrobio.

3. CATEGORÍAS DE ESTUDIOS PROTEÓMICOS MEDIOAMBIENTALES

3.1. Estudios de laboratorio de microorganismos medioambientales modelo

En la actualidad, la mayoría de los estudios proteómicos de microorganismos ambientales se realizan con microbios modelo bien conocidos que se pueden cultivar fácilmente en condiciones controladas en el laboratorio. Estas especies se eligen por sus características esenciales para el medio ambiente, como la capacidad de soportar, degradar o precipitar sustancias tóxicas para los hábitats terrestres/acuáticos y una profunda flexibilidad hacia los donantes/aceptores de electrones, el carbono y las fuentes de energía. La proteómica ambiental podría contribuir a dilucidar sus funciones en hábitats específicos y mejorar su aplicación potencial en biotecnología ambiental. Además, los genomas de todos estos microbios están secuenciados o pueden secuenciarse fácilmente, lo que facilita la comprensión de sus funciones en los hábitats particulares mencionados y la obtención de sus perfiles proteómicos. En la Tabla 3.1 se enumeran los estudios proteómicos de varios grupos de especies microbianas y los logros de la investigación que revelan sus capacidades metabólicas únicas.

Tabla 3.1. Estudios proteómicos de diferentes especies microbianas y logros de la investigación.

Grupo microbiano	Punto de interés	Estudios proteómicos
g. *Bacillus*	– Representantes de g. Bacillus – bacterias Gram positivas modelo con distribución cosmopolita; – Características atractivas que aumentan la supervivencia en condiciones de estrés (esporulación, formación de biopelículas, virulencia de algunas especies); – Herramientas de biología molecular bien desarrolladas para la manipulación de genes.	– Análisis proteómicos de B. subtilis para revelar características fisiológicas. – Cartografía proteómica completa de representantes de g. Bacillus – Estudios proteómicos para dilucidar el comportamiento en ambientes extremos a nivel regulatorio; – Análisis proteómicos para la formación de biopelículas.
g. *Pseudomonas*	– Técnicas de cultivo bien desarrolladas – Metabolismo versátil (auto/litotrófico) con respecto a la utilización de fuentes de C y energía, descomposición dependiente de O₂ – Biodegradación de xenobióticos (hidrocarburos alifáticos y aromáticos) – Tolerancia a contaminantes no degradables	– Análisis proteómicos para la formación de biopelículas. – Análisis proteómicos para aclarar su capacidad metabólica para degradar compuestos tóxicos. Análisis proteómicos para caracterizar los escasos requisitos nutricionales relacionados con su metabolismo flexible
g. *Halobacterium*	– Metabolismo atípico – capacidad metabólica para sobrevivir bajo estrés de osmolaridad (ambientes muy/híper salinos); – Atractivo para el rendimiento de bioprocesos industriales	– Estudios proteómicos para dilucidar las capacidades fisiológicas y los procesos de transferencia lateral de genes en contexto evolutivo. – Enfoques proteómicos para el establecimiento de procedimientos eficaces de búsqueda de enzimas halófilas.
Bacterias reductoras de sulfato del g. *Geobacter* y g. *Desulfovibrio*	– Diversidad metabólica en la utilización de fuentes de carbono – Aplicación en biorremediación	– Descripción del proteoma de Geobacter sulfurreducens y anotación de la mayoría de los productos génicos – Análisis proteómicos para revelar las vías metabólicas de la reducción de metales – Transcriptómica de Desulfovibrio vulgaris – identificación de productos génicos y asignación de funciones a proteínas hipotéticas
Bacterias metilotróficas	– Papel activo en la metanogénesis en sistemas medioambientales naturales y artificiales	– Estudios transcriptómicos de Methylococcus capsulatus (Bath) y Methylobacterium extorquens: identificación de proteínas reguladas diferencialmente – Análisis transcriptómico a lo largo de la colonización de plantas: identificación de proteínas órgano-específicas
Bacterias desnitrificantes / deshalogenadores	– Aplicación en biorremediación	– Estudios proteómicos para la evaluación de la respuesta al estrés ambiental – mecanismos reguladores de las vías del tolueno y el etilbenceno – Descubrimiento de subproteomas específicos de vías como resultado de la placticidad metabólica y reguladora – Estudios proteómicos de deshalogenadores – capacidad de deshalogenación de diversos sustratos en función del repertorio enzimático (expresión de deshalogenasas reductoras)
Bacterias fermentadoras y levaduras	– Aplicación biotecnológica	– Estudios proteómicos para comprender mejor las estrategias de supervivencia en condiciones ambientales extremas durante los procesos de fermentación – Análisis proteómicos de BL y bacterias sintróficas (con metanógenos homólogos), y S. cerevisiae para mostrar los genes/patrones regulados al alza.
Cianobacterias / bacterias fotosintéticas	– Aplicación biotecnológica	– Estudios proteómicos para dilucidar el comportamiento microbiano en condiciones de estrés comparando estilos de vida

3.2. Estudios proteómicos de comunidades microbianas naturales

3.2.1. Metaproteomics

Los estudios proteómicos mejoran los datos genómicos, ya que el proteoma de un sistema vivo refleja sus enzimas operativas en determinadas condiciones. Además, los análisis proteómicos enriquecen los perfiles de expresión génica obtenidos mediante la aplicación de microarrays con información sobre las modificaciones postraduccionales de las proteínas. Así pues, la proteómica puede aplicarse a todos los microorganismos, no sólo a aquellos en los que la información genética está secuenciada.

Los hábitats naturales microbianos representan comunidades complejas para las que el enfoque de estudio de la proteómica ambiental puede contribuir significativamente a poner de relieve la estructura y función de los consorcios microbianos. En concreto, este análisis global de las comunidades microbianas en el medio ambiente se denomina metaproteómica. El enfoque del análisis metaproteómico considera las comunidades microbianas como un metaorganismo vivo. Cualquier cambio fisiológico en este metaorganismo registrado a nivel proteómico (es decir, poblacional) puede interpretarse como una respuesta funcional a alteraciones medioambientales. Otra razón para considerar los consorcios microbianos como un organismo completo y no como una simple colección de microbios individuales es la capacidad de estos metaorganismos para intercambiar genes y compartir capacidades metabólicas.

Desde el punto de vista técnico, el enfoque metaproteómico ofrece grandes ventajas en comparación con los análisis bioquímicos/de biología molecular estándar, ya que omite los laboriosos pasos de aislamiento y mantenimiento de cultivos puros y de todas las especies que componen un determinado consorcio microbiano. Además, la metaproteómica arroja luz sobre las polifacéticas relaciones entre los microorganismos de una comunidad. Tal información no es posible generarla con cultivos puros.

Es cierto que los estudios proteómicos suponen un reto mayor que los de los cultivos puros. Las muestras comunitarias sometidas a análisis proteómicos son complejas en contenido y estructura, y comprenden un gran volumen de ORF que deben estudiarse para encontrar genes putativos. Este tremendo número de productos génicos dificulta bastante el procesamiento y la interpretación de los datos, ya que no existen datos de secuenciación genómica para la mayoría de los representantes de los consorcios. El análisis in silico que media la anotación de productos génicos también es crucial para el éxito de los estudios metaproteómicos.

En la actualidad, el avance de los métodos de extracción de proteínas y su identificación directamente en las muestras ambientales (de hábitats acuáticos o del suelo) supera los obstáculos impuestos por los laboriosos enfoques tradicionales y garantiza resultados más rápidos y mejores. La pirosecuenciación, que se está aplicando cada vez más en los estudios metagenómicos, es un buen ejemplo de estos métodos modernos.

3.2.2. Comunidades microbianas naturales

Los estudios metaproteómicos de las comunidades microbianas en sus hábitats naturales ayudan a dilucidar valiosas peculiaridades funcionales de estas comunidades. Se han estudiado comunidades microbianas del suelo y acuáticas (marinas) utilizando un enfoque metaproteómico, y se ha acumulado información valiosa con potencial aplicación práctica.

Por ejemplo, las comunidades microbianas de las aguas superficiales se estudiaron inicialmente mediante SDS-PAGE 1D y 2D. Estos enfoques metodológicos dieron lugar a la generación de huellas dactilares de proteínas y, en el caso de algunas de ellas, a su caracterización funcional. Siguiendo el avance tecnológico, se exploró la técnica shotgun para estudiar las biopelículas microbianas de los drenajes de minas ácidas. Este enfoque dio lugar a la identificación de más de 2000 proteínas utilizando un conjunto de datos de secuencias generadas a partir del mismo hábitat ambiental. Los estudios metaproteómicos se utilizaron para identificar el repertorio proteico de cepas individuales, que resultaron dominantes en la comunidad. Así pues, se acumulan pruebas de la transferencia horizontal de genes que contribuyó al éxito de la adaptación microbiana a las duras condiciones ambientales del hábitat de la mina de ácido.

También están avanzando los estudios metaproteómicos de las comunidades microbianas del suelo. El cuello de botella de los enfoques metodológicos es la falta de tecnología que permita la extracción directa de proteínas del complejo medio edáfico. Hay que tener en cuenta que las proteínas extraídas tienen que ser de cantidad y calidad suficientes para generar datos proteómicos fiables. Buscando resolver este problema obstaculizador, los científicos consiguieron generar huellas dactilares del proteoma del suelo en una matriz modelo de materia orgánica disuelta. Utilizando este enfoque, determinaron la presencia de abundantes enzimas hidrolíticas lacasa y celulasa. Propusieron su uso como indicadores de la presencia de microorganismos activos en un ecosistema definido. Se ha utilizado otro modelo de matrices ambientales complejas para evaluar la presencia de microorganismos diana en concentraciones muy bajas (en torno al 6%).

Estos datos se recomiendan para evaluar la presencia de posibles agentes de amenazas biológicas que reflejen la escasa abundancia de especies.

3.2.3. La importancia de la diversidad funcional de las comunidades microbianas vista a través de la proteómica

El estudio de la reserva de proteínas en los sistemas vivos está ganando cada vez más popularidad. En consecuencia, se amplía la entrada de datos bioinformáticos. Además de estos sólidos flujos de información sobre la estructura y la función de las proteínas, la relación directa de la estructura y el funcionamiento de la comunidad microbiana con un ecosistema y la estimación de los perfiles de proteínas individuales es difícil. Para revelar la importancia funcional de la diversidad proteínica en un ecosistema, 1) hay que caracterizar la diversidad proteínica y 2) analizar el conjunto proteómico. Para ello, se utilizan sistemas modelo en condiciones controladas que ajustan los datos experimentales al modelo estadístico concreto. La identificación de proteínas y la abundancia cuantitativa relativa en los sistemas modelo son el primer paso obligatorio en este enfoque. No es posible determinar la cantidad absoluta ni toda la diversidad de proteínas en un ecosistema. Los datos estiman cifras como 1 x 104 – 109, incluso 1010 en los conjuntos proteómicos, que contienen tanto pro- como eucariotas. Dado que existe una notable correspondencia entre los datos de biodiversidad y los de proteómica medioambiental comparados mediante el procedimiento de muestreo de índices, los datos analíticos brutos y los datos de referencia, los enfoques estadísticos aplicados habitualmente para el análisis de datos de biodiversidad también pueden aplicarse a los datos de proteómica medioambiental. Este enfoque analítico mutuo ayudará a seguir explorando los patrones de diversidad proteómica y a evaluar su significado funcional.

Benndorf et al. (2007) han establecido un protocolo para el análisis metaproteómico de aguas subterráneas y suelos dirigido a revelar los aspectos funcionales de una determinada comunidad microbiana.

4. ÁREAS DE INVESTIGACIÓN Y APLICACIÓN DE LA PROTEÓMICA MEDIOAMBIENTAL

4.1. Ingeniería metabólica

La ingeniería metabólica es una rama multidisciplinar de la ciencia que se ocupa de la generación de productos deseables mediante la manipulación de las características metabólicas de un organismo huésped. Como elemento esencial del diseño eficaz de proteínas, la ingeniería metabólica contribuye a la biosíntesis de proteínas de valor añadido con alta productividad. Además de su gran ventaja en el diseño y producción de productos específicos mediante la optimización de los procesos genéticos y reguladores dentro de los productores celulares, la ingeniería metabólica se enfrenta a ciertos obstáculos que dificultan su aplicación práctica. Por ejemplo, junto con la producción de proteínas exocelulares, la célula huésped experimenta cambios fisiológicos que repercuten en otros procesos celulares, especialmente en la producción de las demás proteínas de la célula huésped. Los análisis proteómicos pueden contribuir significativamente a dilucidar la respuesta de la célula huésped a la expresión de genes heterólogos, ya que el proceso está catalizado y/o regulado por proteínas o complejos proteicos, y pueden predecirse alteraciones en su producción a lo largo de la expresión de los genes exógenos. El análisis proteómico proporciona datos valiosos durante la expresión heteróloga de enzimas intracelulares basadas en este patrón de acción fundamental durante la ingeniería metabólica. Ejemplos de ello son la expresión del glutatión S-transferasa y la epóxido hidrolasa (componentes esenciales del sistema de defensa antioxidante enzimático celular). Mediante un enfoque proteómico cuantitativo, Lee et al. (2006) descubrieron que la aplicación de esta estrategia de ingeniería metabólica conducía a la inducción de las enzimas del metabolismo del piruvato, la síntesis de glutatión y la defensa antioxidante, y a la represión de las enzimas de la gluconeogénesis, el TAC, la síntesis de indoles y la síntesis de ácidos grasos.

El microbio intestinal Escherichia coli, aunque no es nativo del suelo ni de los medios acuáticos pero se utiliza como huésped clásico de la ingeniería metabólica, también se ha estudiado ampliamente con las herramientas de la proteómica ambiental. Los análisis del comportamiento de E. coli en un contexto ecológico, basados en el estudio del proteoma de la cepa de E. coli sometida a ingeniería metabólica para la biodegradación del tricloroeteno con la introducción de seis genes de la cepa Burkholderia cepacia G4, demostraron que la fisiología de la cepa huésped alterada metabólicamente cambia debido a la inserción de los genes.

4.2. Ecología microbiana

Los estudios ecológicos tradicionales buscan la adaptación natural de las bacterias a su entorno. La proteómica ambiental contribuye a estos estudios al proporcionar información sobre los mecanismos de adaptación, especialmente en condiciones ambientales extremas (por ejemplo, hipertermófilas). Así, las proteínas de los hipertermófilos centran la investigación debido a su mayor estabilidad conformacional y operatividad a altas temperaturas. El estudio de este fenómeno arroja luz sobre los mecanismos moleculares del plegamiento de las proteínas. Prosinechki et al. (2006) han estudiado la arquea hipertermofílica perteneciente al g. Sulfurispharea, que puede crecer dentro del rango térmico de 70 – 97^oC. Utilizando la técnica de perturbación dinámica del proteoma, han identificado proteínas con mayor estabilidad implicadas en procesos celulares esenciales: desintoxicación, procesamiento de ácidos nucleicos, metabolismo energético, etc.

El estudio del otro extremo de la temperatura, el frío, también ha contribuido a desvelar el mecanismo de adaptación microbiana. Aplicando el análisis proteómico, Qiu et al. (2006) estudiaron la adaptación a las bajas temperaturas de una cepa de Exiguobacterium aislada de sedimentos del permafrost siberiano. Combinando el cromatoenfoque y la EM, los autores identificaron más de 250 proteínas expresadas única o preferentemente a 4 ^{oC. Identificaron proteínas de aclimatación al frío y de choque al frío que indicaban una estrategia celular de adaptación al frío que incluye la regulación de procesos fisiológicos a través de la regulación de proteínas celulares individuales. Cabe especular que las proteínas reguladas a temperaturas más bajas permiten a las células adaptarse a temperaturas cercanas o inferiores a cero. Los estudios proteómicos pueden contribuir a demostrar la hipótesis sobre la adaptación bacteriana al frío. Se necesitan estudios proteómicos exhaustivos para obtener información sobre el conjunto de proteínas de la célula y su funcionamiento. Los pequeños conjuntos de proteínas estudiados en un contexto funcional específico no forman el cuadro completo. Así lo demuestra otro estudio con}Colwellia psychrerythraea, en el que se han comprobado cambios en la fluidez de la membrana celular, la síntesis y captación de compuestos criotolerantes y estrategias para superar las barreras a la captación de C dependientes de la temperatura.

En Psychrobacter sp. Zheng et al. (2006) se demostró un efecto combinatorio de dos factores de estrés abiótico diferentes: la sal y el frío. Se identificaron varias proteínas en la adaptación al frío en presencia de sal, mostrando un efecto combinado de la sal y el frío en la expresión de proteínas.

4.3. Tolerancia al estrés ambiental

La gran ventaja de la proteómica para la identificación de proteínas sin secuenciación genómica hace de este enfoque molecular una herramienta versátil para obtener información sobre las respuestas fisiológicas a las condiciones de estrés abiótico ambiental. La capacidad de la proteómica para ofrecer información de todo el sistema de microorganismos en su entorno nativo insta a su aplicación en la evaluación de la respuesta de los microbios al estrés térmico, químico, oxidativo y de otro tipo. Los estudios proteómicos 2D SDS PAGE y basados en cromatografía son los dos métodos más explorados para estudiar los mecanismos de tolerancia a bajas y altas temperaturas, pH bajo, metales pesados y estrés oxidativo. Estos estudios demostraron la regulación al alza de proteínas conocidas de respuesta al estrés y registraron proteínas implicadas en otras actividades de adaptación/desintoxicación, como las vías de biosíntesis de lípidos, la acumulación de osmoprotectores, nuevas proteínas transportadoras, etc.

Además, se puso de manifiesto que la regulación de la respuesta al estrés podría diferenciarse en caso de que una misma especie esté sometida a distintos tipos de estrés. Un ejemplo típico de esta observación es Desulfovibrio vulgaris expuesto a altas concentraciones de sal, estrés por nitratos y temperaturas elevadas. Los análisis proteómicos mostraron los patrones de proteínas/sistemas proteicos regulados al alza y a la baja en diferentes condiciones de estrés. Se observó que D. vulgaris respondía de forma similar al estrés por NaCl y KCl. Sin embargo, reaccionan de forma diferente al estrés por nitrato y a las altas temperaturas. Además, el estudio proteómico especula con la modificación postraduccional de las chaperonas de las proteínas. Todos estos datos indican que el análisis proteómico revela respuestas al estrés en todo el sistema. Además, este enfoque revela los mecanismos de defensa específicos atribuidos a cada condición de estrés.

5. POTENCIAL DE LA PROTEÓMICA MEDIOAMBIENTAL

5.1. Innovaciones metodológicas y técnicas

En su cuarto de siglo de historia, la proteómica ha pasado de ser un análisis bioquímico de proteínas individuales a convertirse en una técnica para cotejar muy diversas características de las proteínas, como patrones de expresión, estructura, localización, interacciones y modificaciones, en cualquier fase de desarrollo de los sistemas vivos. El objetivo de la proteómica es estudiar la dinámica del proteoma del organismo a lo largo de su desarrollo.

Desde el punto de vista tecnológico, la proteómica se apoya en los últimos avances tecnológicos para alcanzar su objetivo científico. El desarrollo de la electroforesis 2D a finales de los años 90 del siglo pasado permitió cartografiar por primera vez un proteoma completo. Posteriormente, las tecnologías de secuenciación de proteínas potenciaron el desarrollo de la proteómica y ayudaron a revelar toda su capacidad en la identificación y caracterización de proteínas. La alta sensibilidad de análisis que ofrece la espectrometría de masas (EM) y su acoplamiento con tecnologías complementarias en fase gaseosa (por ejemplo, la espectrometría de movilidad iónica) convirtieron la EM en una metodología analítica principal en el análisis proteómico.

Los métodos de extracción y derivatización de proteínas, junto con los enfoques de separación antes mencionados, contribuyen a la capacidad de los investigadores para resolver mezclas complejas de proteínas en sus elementos.

Por último, el tratamiento y la interpretación de la ingente cantidad de datos proteómicos brutos acumulados en las fases experimentales de la investigación se apoyan en los métodos de análisis bioinformático, constantemente perfeccionados, que facilitan la obtención de una visión más profunda de las funciones biológicas y su regulación en los sistemas vivos. La bioinformática, como rama integrada de las matemáticas, la bioestadística y el análisis informático de los biodatos de los estudios genómicos y proteómicos mediante herramientas sofisticadas, ayuda a la anotación e interpretación de los resultados experimentales. Además, este enfoque metodológico ayuda en el diseño de moléculas que puedan interactuar con proteínas de interés y en la predicción de interacciones proteína-proteína. Así pues, la bioinformática es esencial para convertir los datos proteómicos primarios en conocimiento y su aplicación.

Sin embargo, además de estos avances tecnológicos, la metodología proteómica presenta limitaciones que dificultan su aplicación universal. Por ejemplo, sigue siendo imposible obtener datos del conjunto total de proteínas presentes en una muestra debido a su rango de concentración, que es bastante amplio, y también a la falta de una metodología adecuada para la amplificación de proteínas cuya concentración es muy baja.

La Tabla 3.2 presenta los desarrollos tecnológicos recientes de los principales grupos de metodología proteómica, haciendo hincapié en sus ventajas, los cuellos de botella en el rendimiento y los nuevos avances en el estado de la técnica. El gráfico de la Fig. 3.1 esboza cómo se organizan estos enfoques metodológicos en un flujo de trabajo de proteómica.

Tabla 3.2. Sinopsis de los avances tecnológicos recientes de los principales grupos de metodología proteómica.

Método	Ventajas	Riesgos para el rendimiento	Novedades
Métodos individuales
Electroforesis en gel de poliacrilamida 2D (2D-PAGE): método de separación de proteínas basado en su masa y carga (puntos isoeléctricos).	– Alta eficacia: separación de miles de proteínas individuales en un gel; – Alta resolución: 10000 manchas de proteínas por gel; – Visualización de proteínas mediante colorantes conocidos (azul Coomassie, púrpura intenso, plata, etc.).	– Proceso lento – Técnicas que requieren mucha mano de obra – Variaciones de gel a gel; – Limitaciones naturales de las proteínas alcalinas e hidrófobas.	– Utilización de la electroforesis en gel diferencial basada en la fluorescencia; – Acoplamiento de 2D-PAGE con MS para una mejor reproducibilidad y una mayor resolución.
Cromatografía líquida (CL): método de separación cuantitativa e identificación de compuestos en una mezcla compleja.	– Capacidad de análisis de biomoléculas grandes y frágiles; – Capacidad de acoplamiento con EM para el análisis de péptidos y proteínas en mezclas complejas; – LC 2D – separa péptidos para la identificación multidimensional de proteínas.	– Necesidad de pretratamiento de las muestras	– Acoplamiento LC y MS. Aplicación del enfoque LC-MS ascendente: uso de proteasas para la digestión pre-LC-MS de péptidos y la huella de masa de péptidos post-LC-MS para obtener secuencias de proteínas individuales.
Etiquetado por afinidad con código isotópico (marcado ICAT): método de cuantificación relativa de péptidos basado en péptidos marcados como patrones internos.	– Alta precisión: aplicación del método de dilución isotópica estable – Compatible con 2D PAGE	– Requiere la disponibilidad de proteínas que contengan CYS – Ofrece cuantificación relativa de péptidos – Requiere instrumentos de mayor rendimiento	– Versión mejorada del etiquetado IACT: las etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) permiten la cuantificación simultánea de hasta cuatro proteínas en una muestra y la validación estadística de los resultados, una amplia cobertura del proteoma y una mayor sensibilidad.
Espectrometría de masas (EM): técnica de determinación de masas adaptada para la identificación de proteínas basada en el enfoque de la relación masa-carga (m/z) y en el uso de diferentes métodos de ionización:	– MS – la plataforma más potente en proteómica – MS – se puede adaptar a la identificación de proteínas superiores		– Proporciona una huella de masa peptídica; ofrece información específica sobre la secuencia mediante el aislamiento de péptidos individuales y su posterior disociación en fragmentos N- o C-terminales.
– ESI – electro-spray ionization; – MALDI – matrix-assisted laser desorption / ionization – SELDI – surface enhanced laser desorption / ionization	– ESI: automatización facilitada gracias a la compatibilidad de las columnas LC y el instrumento MS – MALDI: analiza proteínas en cantidades de femtomoles; tolera algunas impurezas; transfiere automáticamente la información a una base de datos de búsqueda – SELDI: proporciona un espectro de masas de alta resolución tras la separación LC y la caracterización parcial de microcantidades de proteínas/péptidos retenidos en las superficies de los chips cromatográficos.	– SELDI: las proteínas deben plegarse en una conformación adecuada a lo largo del proceso de inmovilización del array para permitir que se produzcan las interacciones proteína-proteína.	– ESI: permite el descubrimiento rápido de proteínas y el análisis de su expresión diferencial – MALDI: ofrece un análisis directo de imágenes de tejido digerido enzimáticamente in situ
Visualización de fagos: creación de bibliotecas de péptidos/proteínas en superficies víricas y análisis de su actividad.	– Las proteínas permanecen asociadas a sus genes correspondientes y pueden identificarse – Se utiliza in vitro / modelos animales para generar ligandos e identificar dianas relevantes para las enfermedades.
Clonación de dianas de ligandos (péptidos) que se unen a dominios más grandes dentro de las proteínas.	– Aplicado al descubrimiento de nuevos dominios/proteínas

Metodologías acopladas
– LC-FD (derivatización fluorogénica) – un método para la detección y cuantificación de proteínas	– Alta reproducibilidad – Simplicidad de los procedimientos – Análisis proteómico diferencial	– Sistemas Nano-LC-FD-LC acoplados directamente a MS
– LC-MS y MALDI-TOF MS para el análisis de PTMs – un método para la detección y cuantificación de modificaciones postraduccionales (PTMs) de proteínas.	– Especialmente aplicable para el análisis de proteínas expresadas con PTMS: glicosilación, fosforilación y alquilación.	– Aplicación de las columnas de carbono grafítico – Utilización de conjuntos de datos LC-MS para la caracterización y cuantificación glucoproteómica
– LC-MS de péptidos MS-amenable – análisis orientados a proteínas asociadas a funciones celulares esenciales	– Alta sensibilidad de detección – Cuantificación precisa	– Disposición de un pipeline bioinformático que reúne conjuntos de proteínas homólogas y selecciona los péptidos más representativos y específicos del proceso para su análisis dirigido.
– Monolithic LC/MS – un método para la identificación de proteínas y la caracterización de digestos proteolíticos	– Un método rápido – Caudales elevados para columnas capilares o nanométricas que simplifican la manipulación del sistema.	– Aplicación con éxito para la detección y el análisis de proteínas de membrana
– MS-Ion Mobility – descripción de estructuras proteicas terciarias y cuaternarias y transiciones estructurales		– Suministro de valiosa información estructural para la modelización molecular de la estructura y las interacciones de las proteínas.

Figura 3.1. Presentación esquemática del flujo de trabajo de las tecnologías proteómicas. Cho, 2007.

5.2. Proteómica ambiental experimental de un vistazo

La proteómica ambiental puede ampliar nuestros conocimientos sobre cómo interactúan las proteínas en un ecosistema o, al menos, en un conjunto de especies. Comprender los mecanismos de esta interacción arrojará luz sobre el funcionamiento de los procesos ecológicos. Para comprender el significado funcional de las proteínas en un ecosistema, parece razonable e informativo un enfoque que las agrupe en función de sus propiedades bioquímicas, su localización subcelular y los bioprocesos en los que participan. Las bases de datos de ontología génica que clasifican las proteínas en categorías funcionales son una buena opción en este contexto, y la proteómica podría contribuir a la generación de nuevos conocimientos ecológicos, ya que proporciona información sobre proteínas funcionalmente equivalentes producidas por (micro)organismos que viven en entornos similares. Así, en lugar de caracterizar todo el conjunto de proteínas de un ensamblaje, es mejor centrarse en un número menor de proteínas identificadas para cambiar su cuantificación como respuesta a las condiciones ambientales. Experimentalmente, un ecólogo podría añadir o eliminar una especie de un ensamblaje y averiguar cuál es la responsable de responder a un determinado factor ambiental. El planteamiento descrito, denominado fenotipado molecular de un ensamblaje, contribuye a nuestro conocimiento del funcionamiento de las proteínas y su dinámica desde una perspectiva temporal. Esto ayudará a los ecólogos a predecir qué proteínas desempeñan un papel esencial en el ecosistema.

Además, los resultados experimentales en la síntesis de proteínas in vitro ayudarán a los ecólogos a diseñar mesocosmos experimentales específicos como modelos de redes tróficas y a seguir el destino de las proteínas dentro de ellas en diversas condiciones ambientales o a enriquecer los ecosistemas con proteínas y metabolitos potencialmente esenciales y medir las respuestas de las redes tróficas. Así, la cuantificación del proteoma ecológico y la medición de la respuesta de la biodiversidad cuando se añaden o eliminan especies de un ecosistema o se le añaden proteínas sintetizadas artificialmente proporcionarán una visión profunda de las funciones de las proteínas en la organización de los ecosistemas.

6. RETOS, FRONTERAS Y PERSPECTIVAS DE LA PROTEÓMICA MEDIOAMBIENTAL

La proteómica es una poderosa rama de la ómica que posee el potencial de ampliar aún más los estudios de microbiología, ecología microbiana y biotecnología ambiental. En la actualidad, la mayoría de los estudios de proteómica ambiental con microorganismos se realizan en laboratorio. Sin embargo, las primeras investigaciones de metaproteómica arrojaron luz sobre la capacidad de la proteómica para contribuir a la identificación y caracterización de proteínas dentro de consorcios microbianos, además de la falta de datos de secuenciación o peculiaridades filogénicas. Uno de los retos más importantes que amenazan el desarrollo de la proteómica medioambiental es la necesidad de desarrollar métodos de extracción de proteínas a partir de comunidades microbianas en diferentes medios (suelo, agua). Por otra parte, los avances en la ciencia bioinformática y sus herramientas también anticipan una mejor identificación de péptidos y proteínas a partir de los datos brutos de la metaproteómica.

Las proteínas dan la estructura celular, generan energía, sustentan la comunicación y permiten la reproducción. Así, proporcionan las redes estructurales y funcionales de la célula viva. Mientras que la información genética es estática, el componente proteico de una célula es dinámico. Es bien sabido que las proteínas son mucho más complejas y difíciles de trabajar que los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Este reto desencadenó la investigación sobre péptidos/proteínas y configuró las perspectivas de la proteómica en relación con:

Propiedades físico-químicas de las proteínas.Se trata de las estructuras secundarias y terciarias que hay que tener en cuenta y mantener durante el análisis; el proceso de desnaturalización que hay que considerar, y los factores potenciales de desnaturalización pertinentes: enzimas, temperatura, irradiación, fuerzas mecánicas, etc.; los problemas de solubilidad de las proteínas que hay que resolver…
Cuantificación de proteínas. Hay que tener en cuenta que las proteínas no pueden amplificarse como el ADN y, cuando no son abundantes, no pueden detectarse. La tecnología recientemente desarrollada por Thulasiraman et al. (2005) explora perlas de bibliotecas de ligandos que permiten acceder a muchas proteínas a concentraciones mínimas y que son prácticamente indetectables por las técnicas analíticas clásicas. Este enfoque permite rastrear la concentración de proteínas en sus ligandos de afinidad específicos.
1. Microarrays y sensibilidad a las proteínas. Nettikadan et al. (2006) propusieron una técnica que combina microarrays y cribado de pequeños volúmenes de muestra para diseñar los llamados ultramicroarrays que ofrecen una alta especificidad y alta sensibilidad que ayudan a superar el problema con los pequeños volúmenes y cantidades de proteína. Este enfoque estratégico produce técnicas fiables para tratar cantidades limitadas de proteínas.
2. Integración multiómica.La integración de la proteómica con la genómica y la metabolómica sigue siendo un reto, pero posee el potencial de revelar la diversidad funcional de las proteínas. Así, la proteómica contribuye al desarrollo de la genómica funcional en beneficio de la investigación biomédica y repercute en el desarrollo de productos innovadores para el diagnóstico y la terapia.

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