Модул 1 – Геномика: методи за вземане на проби за ДНК от околната среда

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Вземането на проби, извличането и анализът на ДНК, която се задържа в околната среда, е едно от най-съществените технологични и научни нововъведения през последното десетилетие. Извличането на ДНК от проби от околната среда, т.нар. екологична ДНК (еДНК), е мощен подход за получаване на информация за видове, популации и съобщества, независимо от физическото им присъствие в природата като индивиди или като култивируеми микроорганизми. Устойчивостта на ДНК в околната среда и фактът, че от нея могат да се вземат проби, да се извлича и анализира, се считат за съществени научни и технологични постижения на нашето време, свързани с мониторинга на видовете и инвентаризацията на техните естествени местообитания. По този начин ДНК от околната среда хвърля светлина върху фундаментални и приложни изследвания в областта на молекулярната биология, науката за околната среда, екологията, палеонтологията и др.

Използвайки ДНК от околната среда от една проба, може едновременно да се анализира ДНК от цяло микробно съобщество, включващо различни таксономични категории. Анализът се състои от PCR амплификация на еДНК, последвано от ДНК секвениране. Амплификацията се организира чрез едновидов или многовидов подход, при който се използват специфични за вида и общи праймери за дадена целева група организми.

Високопроизводителната технология за секвениране от следващо поколение (NGS) в днешно време се развива бързо и допринася за извършването на цялостни проучвания, основани на многовидовия подход за еДНК. Тъй като приложението на тази технология се разширява, тя предлага значително предимство в съотношението цена/стойност в сравнение с класическите методи за секвениране. Освен това многовидовият подход за еДНК набира прогресивна популярност поради развитието на техниката за ДНК метабаркодиране. ДНК метабаркодирането означава използването на масово ДНК секвениране за едновременна идентификация на молекулярно ниво на множество таксони в проба от околната среда. Целевите последователности, амплифицирани чрез PCR, секвенирани и прилагани като баркодове за намиране на дискриминационни таксони, най-често са тези на гени, които имат висока информативност на видово ниво и присъстват в голям брой копия.

Прилагането на подходите на еДНК за описване на биоразнообразието на организмите в древните и съвременните екосистеми чрез получаване на генетичен материал директно от околната среда е основа, върху която могат да се прилагат различни молекулярни методологии и аналитични инструменти, за да се разкрие пълния потенциал на молекулярно-биологичния клон на геномиката на околната среда.

2. ГЕНОМИКА НАКРАТКО

Геномиката е биологична наука, която анализира взаимодействието на гените като обекти на биологична информация на ниво вид, популация и екосистема. Тя се занимава с огромни масиви от генетична информация и я анализира автоматично чрез мрежови концепции с помощта на високопроизводителни изчислителни и биоинформатични технологии.

Корените на геномиката като ДНК-подход за генериране и интерпретиране на данни за генома датират от 70-те години на миналия век, когато групата на Фред Санжер разработва метод за секвениране на гени и с негова помощ секвенира първите три генома – на бактериофага Φ-X174, човешкия митохондриален геном и генома на вируса λ. Две години по-късно екипът на Уолтър Фиърс определя за първи път последователността на един ген – гена на протеина от обвивката на бактериофаг MS2. През същото десетилетие геномът на бактериофага Φ-X174 е първият напълно секвениран ДНК геном, а почти 20 години по-късно, през 1995 г., е секвениран първият геном на свободно живеещ организъм – този на бактерията Hemophilus influenzae. Оттогава геномите на видовете, принадлежащи към трите домена на живота – Archaea, Bacteria и Eukarya, се секвенират с огромни темпове.

Понастоящем геномиката се диференцира на няколко подтипа в зависимост от нивото, на което работи, и подходите за идентифициране на гени, които използва.

Функционална геномика. Тя се занимава с анализ на гените на функционално ниво. Методологичните подходи включват два генетични подхода, които се допълват взаимно:
- Напреднала (класическа) генетична методология, която обхваща случайно генерирани мутанти с желания фенотип и използването им за намиране на нормалната последователност на гена и неговата функция;
- Обратна генетична методология, която използва нормалната последователност на гена (получена чрез геномика) и предизвиква целенасочена мутация в този ген, за да наблюдава как тази мутация променя фенотипа. Въз основа на тази промяна се извежда функцията на нормалния ген.
Микрочипова геномика. Тя подобрява идентифицирането на пълна подгрупа гени, които действат по време на специфични времеви или индивидуални етапи от растежа на организма. Чрез този подход може да се определи общият набор от гени, транскрибирани по време на дадено събитие от интерес (напр. микробен растеж в присъствие/отсъствие на О₂, растеж на коренови власинки при растение или производство на пъпки на крайници при животно). Въпреки че целта на класическата геномика е същата (сбор от подмножеството на гените, отнесени към специфичен биологичен процес или условия), тази техника идентифицира гените, за които са индуцирани мутации, и техният фенотипен ефект е лесно проследим.
Сравнителна геномика. Тя изучава еволюционните връзки между организмите и допринася за познанията ни за филогенията на живота. От методологична гледна точка, благодарение на секвенирането на цели геноми, сравнителната генетика предлага откриване на много по-специфични и незначителни разлики в организмите и по този начин допълва данните от класическата генетика (размер и брой на хромозомите и бандови модели между популациите, родовете и видовете) за еволюционните взаимоотношения. Основното предимство на сравнителната геномика в този смисъл е, че тя сравнява ДНК на организмите директно в малък мащаб. Тъй като ДНК последователностите се обработват и измерват чрез математически подход, геномният анализ е прецизно количествено определен и може да измерва специфични степени на родство.
Геномика на околната среда. Тя обединява данни за околната среда и метаданни, натрупани на различни нива на организация на организмите (от клетката до екосистемата). Този клон на науката благоприятства интердисциплинарността като философия и прилага методология за разбиране на сложността и функциите на гените и организмите в тяхната динамика и еволюция във времеви и пространствен контекст. Той има за цел да характеризира на генетично ниво факторите, които допринасят за разнообразието на реакциите на организма към стресовите фактори на околната среда. Един от най-мощните инструменти на геномиката на околната среда е идентифицирането и изучаването на гени, реагиращи на околната среда при различните видове, за да се ускорят откритията на науката за здравето на околната среда.

3. ДНК НА ОКОЛНАТА СРЕДА

3.1. Определение – еДНК като инструмент за мониторинг

еДНК, съкратено от ДНК на околната среда, е ядрена или митохондриална ДНК на организма, освободена в околната среда. еДНК може да произхожда от всякакъв клетъчен материал. Типични източници на еДНК от макроорганизми са свалената кожа и косми, урината и отделените екскременти, труповете, лигавиците, гаметите и мъртвите индивиди. еДНК от микроорганизми (както про-, така и еукариоти) произхожда от цял организъм. еДНК може да бъде открита навсякъде в сухоземни (почва) или водни (вода и седименти) местообитания. Тя може да бъде взета от проба, открита и наблюдавана чрез техники на молекулярната биология, независимо от наличието на какъвто и да е биологичен изходен материал. еДНК се запазва в природата предимно в зависимост от температурата. Тя може да се запази за няколко седмици във вода с умерен климат до стотици или хиляди години в постоянно замръзнали местообитания. Във водните местообитания концентрацията на еДНК е много ниска и лесно се разпръсква поради хидрологичните процеси. В сухоземните местообитания пробите с еДНК са обогатени с целевия материал в сравнение с водните. Независимо от местообитанието, излагането на еДНК на ултравиолетово лъчение, повишена температура, ниско pH и ендо- или екзонуклеази може да доведе до бързото ѝ разграждане.

Исторически еДНК процъфтява с изследователската идея за получаване на нуклеинови киселини от микроорганизми директно от околната среда в края на 80-те години на XX век. Това беше първият подход за получаване на истинска картина на микробното изобилие в природата, тъй като методите за изследване на микробното разнообразие, основани на култивиране, изопачават ситуацията в естествени условия. еДНК се считаше за уникален инструмент, разкриващ тяхното генетично представяне и внасящ поглед върху микробното разнообразие и функционалната геномика.

В днешно време еДНК се използва като инструмент за откриване на целеви видове и оценка на биологичното разнообразие в екосистемите. Тя може да се определи като подход за получаване на генетичен материал от околната среда, последван от разнообразие от молекулярни методи и инструменти, използвани за анализ, за да се получи по-задълбочен поглед върху фундаменталните и приложните аспекти на инвентаризацията и мониторинга на видовете, екологията, консервационната биология, палеонтологията и науката за околната среда.

3.2. Области на приложение на eДНК

3.2.1 еДНК с микробен произход

Метабаркодирането на еДНК, като нов метод за оценка на биологичното разнообразие, включва вземане на проби от околната среда (водна, сухоземна или дори въздушна), извличане на ДНК, амплифициране чрез PCR с общи или универсални праймери и секвениране на амплификационния продукт чрез NGS за генериране на огромно количество необработени секвенционни данни. Тези данни са източник на ценна информация за присъствието на определени видове в дадено съобщество и оценка/мониторинг на нейното биологично разнообразие във всички местообитания и таксономични групи. По този начин метабаркодирането на еДНК е основен инструмент за екологичен мониторинг и проучвания за опазване на околната среда.

Метабаркодирането на еДНК като методологичен подход се характеризира с висока чувствителност, таксономична селективност и рентабилност, като представлява ефикасен и прецизен инструмент за биомониторинг. Вече почти десетилетие метабаркодирането на еДНК се използва за характеризиране на водни и сухоземни местообитания, сред които такива, които са труднодостъпни за традиционните инструменти за екомониторинг, не само за определяне на видовия състав, но и за откриване на биоинвазия, изучаване на екологията на трофичните вериги, идентифициране на криптични, редки или застрашени видове, реконструкция на древни екосистеми, мониторинг на качеството на въздуха, водата и почвата.

Сухоземни местообитания

Въпреки методологичното предизвикателство, свързано с краткото време на полуживот на еДНК в почвата, метабаркодирането на еДНК се използва за откриване на видове в земните екосистеми. еДНК се прилага за характеризиране на микробните съобщества в сухоземните екосистеми с принос към изучаването на тяхната структура и функция. Функционалното анотиране на предсказаните протеини от различни сухоземни местообитания и причисляването им към различни ортоложни групи дава възможност за оценка на изобилието или недостига на микробно разнообразие именно в тези местообитания. Такъв функционален анализ, съчетан с двуизмерен клъстерен анализ, позволява сравнително изследване на функционалните профили по отношение на кодираните белтъци на сродни земни местообитания и да се установи кои гени са особено обогатени или ограничени в дадено местообитание. Всичко това позволява на изследователите да прогнозират функционалните различия сред микробните съобщества. Освен това този подход дава възможност да се разберат връзките генотип-фенотип и да се изградят модели за динамика на екосистемите, които хвърлят светлина върху глобалното микробно биоразнообразие. eДНК метабаркодирането намалява разходите за вземане на проби от микроорганизми, преодолявайки препятствието на зависимите от култивиране методи за изследване на числеността на микробните видове и негативните последици от тях.

Прилагането на секвениране на еДНК, изолирана от различни сухоземни местообитания, съчетано с количествен анализ на генното съдържание, доведе до генериране на специфични за местообитанието микробни отпечатъци. Тези пръстови отпечатъци се приписват на специфичните среди на пробите и отразяват техните специфични характеристики.

От друга страна, идентифицирането на гени, типични за дадена среда, чрез сравнителни анализи, насочени към гените, разкрива нови перспективи за интерпретиране и диагностициране на данните за околната среда. По този начин метабаркодирането на еДНК на проби от региони, ендемични за микробни патогени, може да се използва за откриване на наличието на патогени и техните потенциални организми-гостоприемници заедно с микробиомите, свързани с устойчивостта на тези патогени в околната среда. Освен това метабаркодирането на еДНК може да се прилага за мониторинг и наблюдение на патогени. То може да се използва за проектиране на системи за наблюдение на взаимодействието между гостоприемник, патоген и околна среда и за ранно предупреждение за риск от заболяване преди проявата му.

Удобството и универсалността на приложението на метабаркодирането на еДНК се използват за наблюдение и изучаване на застрашени местообитания на Земята чрез откриване на инвазивни видове и опазване на застрашените.

Водни местообитания

Сравнително бързото разпръскване и ниската концентрация на водната еДНК превръщат традиционните методи за оценка на микробните видове във водни проби в истинско предизвикателство. Въпреки това измерването на микробните съобщества в сладка и морска вода чрез метабаркодиране на еДНК и генериране на хиляди ампликонови последователности помогна за откриването на местни (малко или редки) видове на определени водни местообитания и за подобряване на оценката на биологичното разнообразие. Баркодирането на еДНК помага за количественото определяне на про- и еукариотните микробни форми на живот и за откриването на съществуващи видове, описването на нови и подобряването на цялостното разбиране на сложната микробна динамика на водните екосистеми. Освен това метабаркодирането на еДНК може да се използва за определяне на инвазивни водни видове. Това става чрез прилагане на периодични скринингови процедури за едновременно откриване и наблюдение на различни инвазивни видове.

Задълбочено проучване на бактериалните рРНК ампликони от проби, които обхващат водните местообитания на световния океан – от повърхността до дъното на дълбоките морета, разкри разликите между пелагичните и бентосните микробни общности на всички таксономични нива. Съставът и динамиката на микробните съобщества бяха сравнени в повърхностни и дълбоки води и в кислородни/аноксигенни екосистеми. Установените разлики отразяват хетерогенността и динамиката на тези местообитания и ограниченията на околната среда (напр. наличие/липса на кислород, влияние на сушата, продуктивност на повърхностните води, качество на водата и т.н.) в тях. Всички тези данни показват, че глобалното изследване на бактериалното разпределение във водните екосистеми дава възможност за хоризонтално и вертикално картографиране на микробните съобщества, изготвяне на регионална картина на микробното разнообразие и стартиране на модели на разпределение, които определят биогеографските бактериални биоми във водните екосистеми.

3.2.2 еДНК на макроорганизми

еДНК, извлечена от макроорганизми, се различава по своята същност от еДНК на микроорганизмите. Докато микробната еДНК представлява цели живи организми в пробата, еДНК от микроорганизъм в пробата съответства само на част от ДНК без организми и клетъчни остатъци.

Откриването и изучаването на еДНК на макроорганизмите е подходящо за целите на опазването на биологичното разнообразие и се прилага в различни сухоземни и водни среди, както съвременни, така и древни. Освен естеството на пробата, работният процес на изследванията на еДНК обхваща следните основни стъпки (Фиг. 1.1.):

Избор на среда (съвременна или древна);
Вземане на проби;
Извличане на ДНК по процедура, специфична за съответната проба от околната среда;
PCR амплификация с помощта на общи/видови праймери за разкриване на биоразнообразието;
Секвениране на ампликони;
Биоинформатична обработка на данните;
Определяне на видовете и тълкуване на резултатите.

Оценка на биоразнообразието в древни среди

Древните среди се състоят от сухоземни и водни седименти. Именно тези седименти са първите, от които е извлечена и изследвана еДНК за оценка на биоразнообразието на макроорганизмите. Постиженията на подхода с еДНК в древни екосистеми допринасят за описване на миналото биологично разнообразие и хвърлят светлина върху историята на еволюцията на макроорганизмите. Освен това еДНК от древни среди може да промени времевата рамка на демографията на популациите и да допринесе за по-надеждни прогнози за изчезването им. Тези по-надеждни разсъждения, от своя страна, могат да помогнат за по-доброто разработване и прилагане на стратегии за опазване. еДНК от кожни клетки, изпражнения или урина може да послужи като подкрепящо доказателство за датите на последната поява за установяване на изчезнали видове.

Основните постижения на тези проучвания са обобщени в Таблица 1.1.

Фигура 1.1. блок-схема на изследванията на еДНК. (Източник: Thomsen & Willerslev, 2015 г.)

Таблица 1.1. Оценка на биоразнообразието в древна среда.

Тип на еДНК	Проби/характеристики	Приложения
Седименти
Сухоземни седименти
Седиментна древна ДНК (sedaDNA)	Проби от вечно замръзнали региони с местен произход Получени от фекалии, урина, епидермални клетки и косми от останки на организми (бозайници, безгръбначни, птици, растения), които се намират в пробата	Реконструкция на палеоекосистеми и демонстрация на видовото богатство на древни растителни и животински съобщества
Измиване на ДНК през пластовете	Между пластовете на незамръзнали находища
Водни седименти
Морска еДНК	Най-големият резервоар на еДНК в океаните Кислородните условия запазват еДНК, намалявайки разграждането, предизвикано от нуклеазите	Прилагат се за оценка на антропогенното въздействие върху морските екосистеми Използване на NGS за разкриване на видовото разнообразие в микрогеографски региони
Естуарна еДНК	Полезни за сравнение на еукариотни съобщества
Сладководна еДНК	Доказано съвпадение между таксономичното представяне на видовете в сладководни седименти (въз основа на еДНК от растителен произход) и това на съответните макрофосили	Допълващи анализи на макрофосили и полени за по-добро разкриване на биологичното разнообразие По-добра представа за екологичните и еволюционните последици от промените в околната среда
Ледници
eДНК	Древни ледени ядра с местен и далечен произход	Дава представа за растенията и животните от миналото на екосистемите

Оценка на биологичното разнообразие в съвременна среда

Оценката на биологичното разнообразие в съвременните екосистеми е от решаващо значение за разбирането на структурата и функциите на сложните видови съобщества. Тя спомага за измерването на здравето и динамиката на екосистемите при нормални условия и при колебания на околната среда и нарушаване на хомеостазата.

Основните подходи и резултати от оценката на биоразнообразието на макроорганизмите в различни среди са обобщени в Таблица 1.2.

Таблица 1.2. Оценка на биоразнообразието в съвременна среда.

Тип на еДНК	Проби/характеристики	Приложения
Сухоземни местообитания
Повърхностна почва
Вътреклетъчна / извънклетъчна еДНК	eДНК метабаркодиране	Разкрива богатството и разнообразието на видовите съобщества Използване на биоиндикаторни групи за здравето на екосистемите, идентифицирани чрез NGS Отразява общото таксономично богатство и относителната биомаса на отделните видове
Водни местообитания
Сладка вода
еДНК от макроорганизми	Бързото разпадане на еДНК доказва съвременното присъствие на видове и популации	Прилагане на подходи за опазване на околната среда Откриване на инвазивни видове Наличие на слабо разпространени видове Мониторинг на застрашени видове (оценка на относителната численост) Количествено определяне на биомасата и видовия състав
Морска вода
еДНК от макроорганизми	eДНК метабаркодиране	Мониторинг и управление на морското биоразнообразие и ресурси

4. ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ ОТ еДНК

4.1. Разработване на протоколи за eDNA

Вземане на проби

Независимо от целевата среда (сухоземна или водна, древна или съвременна), първата стъпка в работния процес на еДНК е вземането на проби.

Вземане на водни проби: събиране и консервиране (с етанол или Na-ацетат) на водни проби директно от източника или след филтриране през филтри от различни материали (целулозно-нитратни, стъклофибърни или карбонатни). Директната проба изисква незабавно замразяване, а филтърната – замразяване или дехидратиране върху филтърната матрица с етанол.

Вземане на почвени проби: повърхностните почвени проби се събират и запечатват в полиетиленови стерилни торбички и се съхраняват при 4^oC за обработка преди замразяване при -80^oC. Успоредно с това се извършват биохимични анализи на почвени проби от същото място, за да се получат данни за техния химичен състав и характеристики (наличие на органични вещества, основни и неосновни елементи), както и за наличните организми (микроскопско наблюдение).

Екстракция на ДНК

еДНК се изолира по добре познати съвременни протоколи и китове, като се взема предвид съответната проба от околната среда. След като бъде извлечена от пробите, еДНК е стабилна, ако бъде пречистена и запазена чрез замразяване. Важен проблем, който може да застраши резултата, е предполагаемото кръстосано замърсяване между видовете. Ето защо е необходимо да се внимава при съхранението на пробите и процедурите за екстракция на еДНК.

PCR амплификация

Въпреки че еДНК може да се анализира чрез конвенционални PCR методи, количественият PCR (qPCR) е предпочитан инструмент, тъй като е по-чувствителен, не се кръстосва и не дава фалшиво положителни реакции. Решаващият етап в qPCR е дизайна на праймерите и сондите.

Праймерите се проектират така, че да отговарят на два различни подхода: едновидов подход, насочен към специфичен за вида ДНК регион, и многовидов подход, при който се използват общи праймери за дадена (мултитаксова) група организми. И в двата случая сондата се използва за предоставяне на количествена информация.

Проектирането на специфични за вида праймери и сонди за qPCR включва съставянето на цялостна консенсусна последователност, която съдържа цялата видова изменчивост в добре познат ДНК регион. При макроорганизмите се предпочита мтДНК, тъй като тя е по-разпространена от ядрената. Освен това в GenBank има повече данни за последователностите. За генерирането на правии и обратни праймери и сонди се препоръчва софтуерното приложение за qPCR праймери, което позволява амплификация на целевия сегмент от около 100 (90-120) bps. Проектираните праймери и сонди с базата данни на GenBank трябва да се проверят два пъти, за да се избегне кръстосана амплификация с други видове.

Секвениране на ампликони

Ампликоните, получени от qPCR, се подлагат на секвениране. Подходите и платформите за секвениране на ДНК претърпяха огромно технологично развитие – от секвенирането от първо поколение до секвенирането от следващо поколение. Историята на напредъка на този методологичен подход, представена на Фиг. 1.2, обхваща:

Секвениране от първо поколение (FGS) – подходът на технологията „shotgun“ на Sanger. FGS е златният стандарт за секвениране, който предлага висока точност на дълги ДНК фрагменти (700 и 1000 bps). Това обаче е бавен и отнемащ време метод, тъй като в даден момент може да се открие само една матрична верига.
Секвениране от второ поколение (SGS) – базирано на PCR техники;
Секвениране от трето поколение (TGS) – de novoсеквениране, основано на технологията за секвениране на една молекула (SMS). Типът на SMS NANOPORE SEQUENCING използва електрофореза за прокарване на отделни молекули (една по една) през нанопори за секвениране.
Секвенирането от следващо поколение (NGS) е технология за масово паралелно секвениране, която предлага висока скорост и мащабируемост на процеса на секвениране, заедно с дълбоко секвениране на целевите области на ДНК и висока прецизност на резултатите. NGS отнема по-малко време и е по-евтин от традиционния подход за секвениране по метода на Санжер. NGS използва технологиите за секвениране чрез синтез (SBS, ILLUMINA) и секвениране чрез лигиране (SBL, ROCHE 454). Модификация на SBL е секвенирането чрез лигиране и откриване на олигонуклеотиди (SOLiD, ABI SOLID), чиято точност на откриване е дори по-висока от другите NGS методи. Технологията на полупроводниковия чип се основава на секвениране с йонен торент (ION TORRENT), чието основно предимство е ниската цена.

Фигура. 1.2. Технологии и платформи за секвениране на ДНК (Източник: Zhang et al., 2021).

Биоинформатична обработка на секвенирани данни, идентификация на видове и интерпретация на резултатите

Технологията NGS генерира големи количества данни за секвениране на ДНК, които изискват машинна обработка и анализ. В този случай подходът in silico на биоинформатиката помага за сортиране на последователностите, изчистване на грешките и групиране на организмите в различни таксономични нива или, в случай че таксонът не е известен или покритието на ДНК базата данни е слабо, в таксономични единици за молекулярни операции (MOTU). Биоинформатичният подход помага за функционалното анотиране на получените последователности, което предвижда гени, оперони и функционални РНК. Предвиждането на белтъчни последователности позволява добавяне на членове към вече съществуващи групи, създаване на нови ортоложни групи и по-прецизно картографиране на белтъци към отделни ортоложни групи. Този подход определя дали независими проби от еДНК от различни среди притежават сходни функционални профили въз основа на протеините, които кодират.

Стъпки на протокола, при които се допускат грешки

Вземане на проби. Целевият вид определя времето за вземане на проби. То зависи от историята или поведението на индивида и трябва да се избере внимателно, за да не се компрометира качественото представяне и количественото определяне на целевата ДНК в пробата от еДНК.
Дизайн на процедурата.Дизайнът на анализа трябва да отчита както вътревидовите, така и междувидовите вариации. Ако целият набор от генетични вариации на целевия вид не е обхванат, това може да доведе до фалшиво отрицателни резултати. Напротив, ако не е обхванат пълният набор от генетични вариации на съвместно срещащи се и генетично свързани видове, може да се регистрира фалшиво положителен резултат. Ето защо е от съществено значение да се избере генетичен регион, който да покрива наличната генетична информация както за целевия, така и за свързания с него нецелеви вид. По този начин анализът трябва да бъде достатъчно чувствителен и специфичен, за да се намалят до минимум застрашаващите резултати.
Контрол на качеството на процеса. Анализът трябва да включва подходящи положителни и отрицателни контроли за вътрешна проверка на резултатите и осигуряване на тяхното качество. Тези контроли трябва да обхващат всички етапи на процеса:
Екстракция на ДНК – отрицателна контрола за откриване на кръстосано замърсяване между екстрактите;
PCR амплификация – вътрешна положителна контрола за всяка ямка, за да се сигнализира за инхибиране на реакцията; извършване на екстракцията на еДНК и qPCR в лаборатория, в която не се работи с други ДНК проби;
Пробите от разградена и нискокачествена ДНК трябва да се правят в три повторения, за да се избегнат фалшиви положителни резултати;
Трябва да се разработят стандартни криви за ДНК, получени от различни проби от един целеви вид, за да се разшири обхватът на резултатите от пробите;
Контрол на процеса: отрицателна контрола, включваща видове извън обхвата на целевите видове, и отрицателна контрола, включваща проби от дестилирана вода; използване на стерилни консумативи и стъклени съдове.
Точност на откриване. Необходимост от повторни проби, за да се избегне несигурността и да се определят долните граници на откриване, които не са известни за всеки вид и варират в зависимост от различни фактори, като количеството на вида, плътността, поведението, околната среда.

4.2. Технически предизвикателства и недостатъци

4.2.1. Недостатъци при получаването и секвенирането на еДНК

Въпреки че приложенията на еДНК са безспорни, има няколко въпроса, които се считат за проблемни и са източник на неправилно интерпретирани или ненадеждни резултати. Основните капани, проблемите, които те пораждат, и подходите за тяхното разрешаване са обобщени в Таблица 1.3.

Таблица 1.3. Основни технически капани на еДНК и подходи за тяхното разрешаване.

Пречка	Проблемен въпрос	Подход на елиминиране
Контаминация	Възможни пътища на замърсяване: вземане на проби, всички лабораторни анализи Кръстосано замърсяване: смесени ДНК от различни места Разпространение на копия на ДНК в цялата лаборатория Фалшиви положителни резултати	Минимизиране на броя на последователностите, получени в дадена проба Извършване на независими PCR реакции за постигане на един и същ успех на амплификацията Физически разделяне на процесите преди и след PCR Включване на празни проби за етапите на вземане на проби, извличане на ДНК и PCR
Инхибиране на ензими	Съвместното извличане на ДНК и хуминови вещества води до инхибиране на Taq полимеразата Генериране на фалшиво отрицателни профили	Избягване извличането на хуминови киселини
Грешки, генерирани от PCR и секвениране	Точкови мутации и образуване на химерни молекули Фалшиви положителни резултати при секвениране	Филтриране на необработени данни за секвениране и практикуване на „деноализацията“ на сигналите Търсене на компромис между изрязването на грешките и запазването на възможно най-много информация за секвенцията
Времева и пространствена последователност на резултатите	Времето за разграждане на еДНК от различни местообитания варира от няколко дни до векове, което води до ниска времева и специална съгласуваност на резултатите. Пренасяне на еДНК в рамките на (предимно водни) екосистеми	Внимателно тълкуване на резултатите в пространствен и времеви мащаб
Внедряване на eDNA	Едновидов подход – открива само един вид в даден момент Многовидов подход (ДНК метабаркодиране) – амплифициране на определени последователности (видове) по-малко ефективно от други (видове) Надеждност на количественото определяне чрез qPCR – определяне на истинските положителни резултати от фона Трудности при превръщането на разнообразието от ДНК последователности във видово разнообразие, поради ограничаването на еДНК до къси последователности с ниска таксономична разделителна способност	Оптимизиране на общи праймери за целите на метабаркодирането Използване на стандартизиран брой повторения на qPCR Генериране на модели за производство и разграждане на ДНК Запълване на пропуските в базите данни с ДНК последователности Стандартизиране на клъстеризацията на последователности от данни за метабаркодиране

4.2.2. Предизвикателства при интерпретирането на данните

Тълкуването на резултатите от изследванията на еДНК изисква солиден критичен подход. Основните предизвикателства при тълкуването на данните от еДНК са свързани с методите за откриване на еДНК, които не правят разлика между живи и мъртви организми, определени жизнени стадии (за животни със сложен жизнен цикъл) и хибридни видове (поради използването на мтДНК, която открива само майчината линия при хибридните видове). От друга страна, еДНК открива само част от общия брой места, заети от даден вид. В този смисъл са необходими надеждни оценки на заетостта на видовете по данни от еДНК.

Техническите предизвикателства при интерпретацията на данните от еДНК налагат друг въпрос, свързан с разработването на стандартни общи протоколи за удостоверяване на резултатите от изследванията на еДНК, особено тези, свързани с представянето и опазването на биологичното разнообразие.

5. Потенциал на приложенията на еДНК

5.1. Усъвършенстване на методите и протоколите за откриване на еДНК

Същественото усъвършенстване на методите и протоколите за еДНК с цел ефективно преодоляване на горепосочените трудности и недостатъци налага бъдещите изследвания на електронната ДНК в сухоземни и водни екосистеми за мониторинг на биологичното разнообразие да бъдат насочени към следните основни теми.

Проучване на пространственото и времевото разпределение на еДНК в различни местообитания, за да се осигури ефективен мониторинг на устойчивостта на видовете в пространството и времето;
Установяване на по-добре представени връзки между количеството на еДНК и числеността на видовете, за да се даде възможност за надеждни заключения относно индивидуалната плътност или общото наличие на биомаса;
Прецизно определяне на източника на еДНК, за да се сведат до минимум грешките при тълкуването на числеността на видовете;
Отчитане на влиянието на абиотичните фактори (Т оС, рН, соленост, ултравиолетово лъчение), които влияят върху наличността на еДНК и скоростта на разграждане;
Прилагане на технически подобрения, като например получаване на по-дълги ДНК фрагменти, насочване към ядрени гени и използване на метабаркодирането на еДНК в широк мащаб и в по-сложни екосистеми.

5.2. Напредък в прилагането на еДНК за оценка на биологичното разнообразие

Технологията за еДНК предлага значителни предимства в сравнение с традиционните подходи за мониторинг на биологичното разнообразие. Нейният методологичен напредък включва следните основни характеристики.

Стандартизирани условия на протокола за еДНК: от вземането на проби до интерпретацията на данните от секвенирането;
Неинвазивен характер: технологията eДНК е абсолютно безвредна за изследваните видове и техните екологични местообитания;
Независимост на видовете, географскотж местоположение и метеорологичните условия;
Висока разделителна способност на откриването. eDNA технологията се характеризира с голяма чувствителност. Нейните методи са доказано по-добри от традиционните, когато е трудно да се разграничат и идентифицират видовете от близкородствени аналози.
Благоприятно съотношение цена/стойност. eDNA предлага по-кратко време за обработка и по-ниски разходи в сравнение с традиционните подходи за мониторинг на биологичното разнообразие. подходът за метабаркодиране на eDNA постепенно става по-добър от традиционните методи, като цените на NGS намаляват;
Извънредна необходимост от нови поколения технологии за секвениране в реално време и спектроскопски методи.

6. ЛИТЕРАТУРА

Andersen, K., Bird, K.L., Rasmussen, M., Haile, J., Breuning-Madsen, H., Kjaer, K.H., Orlando, L., Gilbert, M.T.P., Willerslev, E. (2012). Meta-barcoding of ‘‘dirt’’ DNA from soil reflects vertebrate biodiversity. Mol. Ecol. 21, 1966–1979. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-294X.2011.05261.x.

Anderson, I.C., Cairney, J.W.G. (2004). Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environ. Microbiol. 6, 769–779. http://dx.doi.org/10.1111/j.1462-2920.2004.00675.x.

Baird, D.J., Hajibabaei, M., 2012. Biomonitoring 2.0: a new paradigm in ecosystem assessment made possible by next-generation DNA sequencing. Mol. Ecol. 21, 2039–2044.

Barnes, M.A., Turner, C.R., Jerde, C.L., Renshaw, M.A., Chadderton, W.L., Lodge, D.M. (2014). Environmental conditions influence eDNA persistence in aquatic systems. Environ. Sci. Technol. 48, 1819–1827. http://dx.doi.org/10.1021/es404734p.

Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J.A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl, M.W., Shipley, G.L., Vandersompele, J., Wittwer, C.T. (2009). The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of QuantitativeReal-Time PCR Experiments. Clin Chem. 55, 611–622.

Caporaso, J.G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F.D., Costello, E.K., Fierer, et al. (2010). QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 7, 335–336. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.f.303.

Coissac, E., Riaz, T., Puillandre, N. (2012). Bioinformatic challenges for DNA metabarcoding of plants and animals. Mol. Ecol. 21, 1834–1847. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-294X.2012.05550.x.

Darling, J.A., Mahon, A.R. (2011). From molecules to management: adopting DNAbased methods for monitoring biological invasions in aquatic environments. Environ. Res. 111, 978–988. http://dx.doi.org/10.1016/j.envres.2011.02.001

Deiner, K., Walser, J.-C., Mächler, E., Altermatt, F. (2015). Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Cons. 183, 53–63.

Dejean, T., Valentini, A., Duparc, A., Pellier-Cuit, S., Pompanon, F., Taberlet, P., Miaud, C. (2011). Persistence of environmental DNA in freshwater ecosystems. PLoS ONE 6, e23398. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0023398.

Egan, S.P., Barnes, M.A., Hwang, C.-T., Mahon, A.R., Feder, J.L., Ruggiero, S.T., Tanner, C.E., Lodge, D.M. (2013). Rapid Invasive species detection by combining environmental DNA with light transmission spectroscopy: eDNA-LTS species detection. Conserv. Lett. 6, 402–409. http://dx.doi.org/10.1111/conl.12017.

Faure, D. and Joly D., 2016. Insight on Environmental Genomics. High-throughput Sequencing. Elsevier Ltd., https://doi.org/10.1016/C2015-0-06337-7

Ficetola, G.F., Miaud, Claude, Pompanon, François, and Taberlet, Pierre, 2008, Species detection using environmental DNA from water samples: Biology Letters, v. 4, p. 423–425, doi:10.1098/rsbl.2008.0118.

Haile, J., Holdaway, R., Oliver, K., Bunce, M., Gilbert, M.T.P., Nielsen, R., Munch, K., Ho, S.Y.W., Shapiro, B., Willerslev, E. (2007). Ancient DNA chronology within sediment deposits: are paleobiological reconstructions possible and is DNA leaching a factor? Mol. Biol. Evol. 24, 982–989. http://dx.doi.org/10.1093/molbev/msm016.

Herder, J.E., Valentini, A., Bellemain, E., Dejean, T., van Delft, J.J.C.W., Thomsen, P.F., Taberlet, P. (2014). Environmental DNA – a review of the possible applications for the detection of (invasive) species. Stichting RAVON, Nijmegen, Report 2013-104.

Kelly, R.P., Port, J.A., Yamahara, K.M., Martone, R.G., Lowell, N., Thomsen, P.F., Mach, M.E., Bennett, M., Prahler, E., Caldwell, M.R., Crowder, L.B., 2014b. Harnessing DNA to improve environmental management. Science 344, 1455–1456. http://dx.doi.org/10.1126/science.1251156

Taberlet, P., Coissac, E., Hajibabaei, M., Rieseberg, L.H., 2012a. Environmental DNA. Mol. Ecol. 21, 1789–1793.

Taberlet, P., Coissac, E., Pompanon, F., Brochmann, C., Willerslev, E., 2012b. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 21, 2045–2050.

Thomsen P.F. and Willerslev E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biological Conservation 183 (2015) 4–18

Zhang L, Chen F, Zeng Z, Xu M, Sun F, Yang L, Bi X, Lin Y, Gao Y, Hao H, Yi W, Li M and Xie Y (2021) Advances in Metagenomics and Its Application in Environmental Microorganisms. Front. Microbiol. 12:766364. doi: 10.3389/fmicb.2021.766364