Modül 1 – Genomik: çevresel DNA ve örnekleme

1. GİRİŞ

Çevrede kalıcı olan DNA’nın örneklenmesi, ekstraksiyonu ve analizi son on yılın en önemli teknolojik ve bilimsel yeniliklerinden biridir. Çevresel DNA (eDNA) olarak adlandırılan çevresel örneklerden DNA elde etmek, doğada bireyler veya kültürlenebilir mikroorganizmalar olarak fiziksel varlıklarına bakılmaksızın türler, popülasyonlar ve topluluklar hakkında bilgi edinmek için güçlü bir yaklaşımdır. DNA’nın çevrede kalıcı olması ve örneklenebilmesi, çıkarılabilmesi ve analiz edilebilmesi, türlerin izlenmesi ve doğal yaşam alanlarının envanterinin çıkarılmasıyla ilgili çağımızın temel bilimsel ve teknolojik gelişmeleri olarak kabul edilmektedir. Böylece eDNA, moleküler biyoloji, çevre bilimi, ekoloji, paleontoloji vb. alanlardaki temel ve uygulamalı araştırmalara ışık tutmaktadır.

Tek bir numuneden alınan eDNA kullanılarak, farklı taksonomik kategorilerden oluşan tüm bir mikrobiyal topluluğun DNA’sı eş zamanlı olarak analiz edilebilir. Analiz, eDNA’nın PCR amplifikasyonundan ve ardından DNA dizilemesinden oluşur. Amplifikasyon, belirli bir hedef organizma grubu için türe özgü ve jenerik primerlerden yararlanan tek tür veya çok tür yaklaşımı ile düzenlenir

Yeni Nesil Dizileme’nin (YND) yüksek verimli teknolojisi günümüzde hızla ilerlemekte ve çok türlü eDNA yaklaşımına dayanan kapsamlı araştırmaların gerçekleştirilmesine katkıda bulunmaktadır. Bu teknoloji uygulaması genişlediğinden, klasik dizileme yöntemlerine kıyasla önemli bir maliyet-değer avantajı sunmaktadır. Ayrıca, çoklu tür eDNA yaklaşımı, DNA metabarkodlama tekniğinin gelişmesi sayesinde giderek daha fazla popülerlik kazanmaktadır. DNA metabarkodlama, çevresel bir numunedeki birden fazla taksonun moleküler düzeyde eşzamanlı olarak tanımlanması için kitlesel DNA dizileme performansı anlamına gelir. PCR ile çoğaltılan, dizilen ve ayırt edici taksonları bulmak için barkod olarak uygulanan hedef diziler, çoğunlukla tür düzeyinde oldukça bilgilendirici olan ve yüksek kopya sayısında bulunan genlere aittir.

Genetik materyalin doğrudan çevreden elde edilmesi yoluyla eski ve çağdaş ekosistemlerdeki organizmaların biyolojik çeşitliliğini tanımlamak için eDNA yaklaşımlarının uygulanması, çevresel genomiğin moleküler biyoloji dalının tam potansiyelini ortaya çıkarmak için çeşitli moleküler metodolojilerin ve analitik araçların uygulanabileceği bir arka plan oluşturmaktadır.

2. BİR BAKIŞTA GENOMİK

Genomik, genlerin biyolojik bilgi nesneleri olarak tür, popülasyon ve ekosistem seviyelerindeki etkileşimlerini analiz eden bir biyobilimdir. Geniş genetik bilgi kümeleriyle ilgilenir ve bunları yüksek performanslı bilgi işlem ve biyoinformatik teknolojilerinin yardımıyla ağ kavramları aracılığıyla otomatik olarak analiz eder.

Genom verilerinin oluşturulması ve yorumlanmasına yönelik DNA temelli bir yaklaşım olan genomiklerin kökleri, Fred Sanger’in grubunun bir gen dizileme yöntemi geliştirdiği ve bunu kullanarak ilk üç genomu, bakteriyofaj Φ-X174’ün genomunu, insan mitokondriyonunun genomunu ve λ virüsünün genomunu tamamladığı 1970’lere kadar uzanmaktadır. İki yıl sonra, Walter Fiers’in ekibi ilk kez bir genin dizilimini belirlemiştir – bakteriyofaj MS2 ceket proteini geni. Aynı on yıl içinde, Φ-X174 bakteriyofaj genomu tamamen dizilen ilk DNA genomu olmuş ve neredeyse 20 yıl sonra, 1995’te, ilk serbest yaşayan organizma genomu dizinlenmiştir – Hemophilus influenzae bakterisine ait olan. O zamandan bu yana, yaşamın üç alanına (Archaea, Bacteria ve Eukarya) ait türlerin genomları muazzam bir hızla dizilenmiştir.

Günümüzde genomik, faaliyet gösterdiği seviyeye ve kullandığı gen tanımlama yaklaşımlarına bağlı olarak çeşitli alt türlere ayrılmaktadır.

Fonksiyonel genomik. Genlerin fonksiyonel düzeyde analizi ile ilgilenir. Metodolojik yaklaşımlar, birbirini tamamlayan iki genetik yaklaşımı içerir:
- İstenen fenotipin rastgele üretilmiş mutantlarını kapsayan ve normal gen dizisini ve işlevini bulmada bunlardan yararlanan ileri (klasik) genetik metodoloji;
- Ters genetik metodolojisi normal gen dizilimini (genomik ile elde edilen) kullanır ve bu mutasyonun fenotipi nasıl değiştirdiğini gözlemlemek için bu gende hedeflenen mutasyonu indükler. Bu değişikliğe dayanarak, normal genin işlevi çıkarılır.
Mikroarray genomiği. Organizma büyümesinin belirli zamansal veya gelişimsel aşamalarında faaliyet gösteren genlerin tam bir alt kümesinin tanımlanmasını geliştirir. İlgilenilen bir olay sırasında (örneğin, O₂varlığında/yokluğunda mikrobiyal büyüme, bir bitkide kök kılı büyümesi veya bir hayvanda uzuv tomurcuğu üretimi) transkribe edilen toplam gen seti bu yaklaşımla belirlenebilir. İleri genetik hedefi aynı olmasına rağmen (belirli bir biyolojik süreç veya koşullara atıfta bulunan gen alt kümesinin bir araya getirilmesi), bu teknik mutasyonların indüklendiği genleri tanımlar ve fenotipleme etkileri kolayca izlenebilir.
Karşılaştırmalı genomik. Organizmalar arasındaki evrimsel ilişkileri inceler ve yaşam filogenisi bilgimize katkıda bulunur. Metodolojik olarak, tüm genomların dizilenmesi ile karşılaştırmalı genetik, organizmalarda çok daha spesifik ve küçük farklılıkların tespit edilmesini sağlar ve böylece evrimsel ilişkiler için klasik genetiğin verilerini (kromozom boyutu ve sayısı ve popülasyonlar, cinsler ve türler arasındaki bant desenleri) tamamlar. Karşılaştırmalı genomiğin bu anlamda temel avantajı, organizmaların DNA’larını doğrudan küçük ölçekte karşılaştırmasıdır. DNA dizileri matematiksel bir yaklaşımla işlenip ölçüldüğünden, genomik analiz hassas bir şekilde ölçülür ve belirli akrabalık derecelerini ölçebilir.
Çevresel genomik. Organizmaların organizasyonunun çeşitli seviyelerinde (hücreden ekosisteme) biriken çevresel verileri ve meta verileri entegre eder. Bu bilim dalı, genlerin ve organizmaların karmaşıklığını ve işlevlerini, zamansal ve mekansal bağlamlardaki dinamikleri ve evrimiyle birlikte anlamada bir felsefe ve metodoloji olarak disiplinlerarasılığı desteklemektedir. Çevresel stres faktörlerine karşı organizma tepkilerinin çeşitliliğine katkıda bulunan faktörleri genetik düzeyde karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Çevresel genomiğin en güçlü araçlarından biri, çevre sağlığı biliminin keşiflerini hızlandırmak için türler arasında çevresel olarak duyarlı genlerin tanımlanması ve incelenmesidir.

3. ÇEVRESEL DNA

3.1. Tanım – moleküler izleme aracı olarak eDNA

Çevresel DNA’nın kısaltması olan eDNA, çevrede salınan organizma nükleer veya mitokondriyal DNA’sıdır. eDNA herhangi bir hücresel materyalden kaynaklanabilir. Makroorganizmalardan gelen tipik eDNA kaynakları deri ve saç dökülmesi, idrar ve salgılanan dışkılar, karkaslar, mukoza, gametler ve ölü bireylerdir. Mikroorganizmalardan gelen eDNA (hem pro- hem de ökaryotlar) bütün bir organizmadan elde edilir. eDNA karasal (toprak) veya sucul (su ve sediment) habitatların her hangi bir yerinde bulunabilir. Herhangi bir biyolojik kaynak materyalin varlığına bakılmaksızın moleküler biyoloji teknikleriyle örneklenebilir, tespit edilebilir ve izlenebilir. eDNA’nın doğadaki kalıcılığı esas olarak sıcaklığa duyarlıdır. Ilıman sularda birkaç haftadan donmuş habitatlarda yüzlerce veya binlerce yıla kadar korunabilir. Sucul habitatlarda eDNA konsantrasyonu çok düşüktür ve hidrolojik süreçler nedeniyle kolayca dağılır. Karasal habitatlarda, eDNA örnekleri hedef materyalde sucul olanlara kıyasla zenginleşir. Habitat ne olursa olsun, eDNA’nın UV radyasyonuna, yüksek sıcaklığa, düşük pH’a ve endo veya ekzonükleazlara maruz kalması hızlı bir şekilde bozulmasına yol açabilir.

Tarihsel olarak eDNA, 20. yüzyılın 80’li yıllarının sonlarında mikroorganizmaların nükleik asitlerini doğrudan çevreden elde etmeye yönelik araştırma fikriyle gelişmiştir. Mikrobiyal çeşitliliği incelemek için kültüre dayalı yöntemler doğal koşullardaki durumu yanlış temsil ettiğinden, doğadaki mikrobiyal bolluğun gerçek resmini elde etmek için ilk yaklaşımdır. eDNA, genetik temsillerini ortaya çıkaran ve mikrobiyal çeşitlilik ve fonksiyonel genomik hakkında fikir veren benzersiz bir araç olarak kabul edilmektedir.

Günümüzde eDNA, hedeflenen türlerin tespiti ve ekosistemlerdeki biyoçeşitliliğin değerlendirilmesi için bir araç olarak kullanılmaktadır. Tür envanterleme ve izleme, ekoloji, koruma biyolojisi, paleontoloji ve çevre biliminin temel ve uygulamalı yönleri hakkında daha derin bilgiler elde etmek için analiz için kullanılan çeşitli moleküler yöntem ve araçların ardından çevreden genetik materyal elde etmek için bir yaklaşım olarak tanımlanabilir

3.2. eDNA uygulama alanları

3.2.1 Mikrobiyal kökenli eDNA

eDNA metabarkodlama, biyoçeşitlilik değerlendirmesi için ortaya çıkan bir yöntem olarak, çevreden (sucul, karasal ve hatta hava) örnekler almayı, DNA’yı çıkarmayı, genel veya evrensel primerlerle PCR yoluyla çoğaltmayı ve büyük miktarda ham dizileme verisi oluşturmak için amplifikasyon ürününü YND yoluyla dizilemeyi içerir. Bu veriler, bir toplulukta tanımlanmış türlerin varlığı ve tüm habitatlar ve taksonomik gruplar genelinde biyoçeşitliliğinin değerlendirilmesi/izlenmesi hakkında değerli bilgilerin kaynağıdır. Bu nedenle, eDNA metabarkodlama ekolojik izleme ve koruma çalışmaları için önemli bir araçtır.

Metodolojik bir yaklaşım olarak eDNA metabarkodlama, yüksek hassasiyet, taksonomik seçicilik ve maliyet verimliliği ile karakterize edilir ve etkili ve hassas bir biyo-izleme aracı oluşturur. Neredeyse on yıldır, eDNA metabarkodlama, geleneksel eko-izleme araçlarıyla ulaşılması zor olan sucul ve karasal habitatların karakterizasyonu için, sadece tür kompozisyonu için değil, aynı zamanda biyo-istilanın tespiti, trofik zincirlerin ekolojisinin incelenmesi, kriptik, nadir veya tehdit altındaki türlerin tanımlanması, eski ekosistemlerin yeniden inşası, hava, su ve toprak kalitesinin izlenmesi için de kullanılmaktadır.

Karasal habitatlar

Toprakta eDNA’nın kısa süreli kalıcılığının metodolojik zorluğuna rağmen, eDNA metabarkodlama karasal ekosistemlerde tür tespiti için kullanılmaktadır. eDNA, karasal ekosistemlerin mikrobiyal topluluklarının karakterizasyonu için uygulanmakta ve yapı ve işlev çalışmalarına katkıda bulunmaktadır. Farklı karasal habitatlardan tahmin edilen proteinlerin fonksiyonel ek açıklamaları ve çeşitli ortolog gruplara atanmaları, bu habitatlardaki mikrobiyal çeşitlilik bolluğunun veya kıtlığının tahmin edilmesini sağlar. İki boyutlu küme analizi ile birleştirilen bu tür fonksiyonel analiz, ilgili karasal habitatların kodlanmış proteinleri açısından fonksiyonel profillerin karşılaştırmalı olarak incelenmesine ve belirli bir habitatta hangi genlerin özellikle zenginleştirildiğini veya kısıtlandığını bulmaya olanak tanır. Tüm bunlar araştırmacıların mikrobiyal topluluklar arasındaki işlevsel farklılıkları tahmin etmelerini sağlar. Ayrıca bu yaklaşım, genotip-fenotip ilişkilerinin anlaşılmasını ve küresel mikrobiyal biyoçeşitliliğe ışık tutan ekosistem dinamikleri modellerinin oluşturulmasını sağlar. eDNA metabarkodlama, mikroorganizmaların örnekleme maliyetlerini azaltarak, mikrobiyal tür bolluğunun araştırılması için kültüre bağlı yöntemlerin ve bunların olumsuz etkilerinin üstesinden gelir.

Çeşitli karasal habitatlardan izole edilen eDNA’nın shotgun sekanslamasının kantitatif gen içeriği analizi ile birlikte uygulanması, habitata özgü mikrobiyal parmak izlerinin oluşturulmasıyla sonuçlanmıştır. Bu parmak izleri, kendine özgü örnek ortamlarına atfedilir ve belirli özelliklerini yansıtır.

Öte yandan, gen merkezli karşılaştırmalı analizler yoluyla belirli bir çevre için tipik olan gen tanımlaması, çevresel verilerin yorumlanması ve teşhis edilmesi için yeni umutlar ortaya koymaktadır. Bu nedenle, mikrobiyal patojen endemik bölgelerden alınan örneklerin eDNA metabarkodlaması, patojenlerin ve potansiyel konakçı organizmalarının varlığını ve bu patojenlerin çevrede kalıcılığı ile ilişkili mikrobiyomları tespit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, eDNA metabarkodlama patojenlerin izlenmesi ve gözetimi için uygulanabilir. Konakçı-patojen-çevre etkileşimini izlemek için sistem tasarımı ve hastalık ortaya çıkmadan önce hastalık riskinin erken uyarısı için kullanılabilir.

eDNA metabarkodlama uygulamasının kolaylığı ve evrenselliği, istilacı türlerin tespit edilmesi ve nesli tükenmekte olanların korunması yoluyla Dünya üzerindeki nesli tükenmekte olan habitatların gözlemlenmesi ve incelenmesi için kullanılmaktadır.

Sucul habitatlar

Sucul eDNA’nın nispeten hızlı dağılımı ve düşük konsantrasyonu, sucul örneklerde mikrobiyal türlerin değerlendirilmesine yönelik geleneksel yöntemleri gerçek bir zorluk haline getirmektedir. Bununla birlikte, binlerce amplikon dizisinin oluşturulması yoluyla eDNA metabarkodlama ile tatlı ve deniz suyundaki mikrobiyal toplulukların ölçülmesi, belirli sucul habitatların yerli (küçük veya nadir) türlerinin tespit edilmesine ve biyolojik çeşitlilik değerlendirmesinin iyileştirilmesine yardımcı olmuştur. eDNA barkodlama, hem pro- hem de ökaryotik mikrobiyal yaşam formlarının ölçülmesine ve mevcut türlerin tespit edilmesine, yenilerinin tanımlanmasına ve sucul ekosistemlerin karmaşık mikrobiyal dinamiklerinin genel olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Buna ek olarak, eDNA metabarkodlama istilacı sucul türlerin belirlenmesi için kullanılabilir. Bu, çeşitli istilacı türlerin eşzamanlı tespiti ve izlenmesi için periyodik tarama prosedürleri uygulanarak yapılır

Yüzeyden derin deniz tabanına kadar küresel okyanusun sucul habitatlarını kapsayan örneklerin bakteriyel rRNA amplikonlarının derinlemesine incelenmesi, pelajik ve bentik mikrobiyal topluluklar arasındaki tüm taksonomik seviyelerdeki farklılıkları ortaya koymuştur. Mikrobiyal toplulukların kompozisyonu ve dinamikleri yüzey ve derin sularda ve oksijenik/anoksijenik ekosistemlerde karşılaştırılmıştır. Belirlenen farklılıklar, bu habitatların heterojenliğini ve dinamiklerini ve buralardaki çevresel kısıtlamaları (örneğin, oksijen mevcudiyeti/eksikliği, kara etkisi, yüzey suyu verimliliği, su kalitesi, vb. Tüm bu veriler, sucul ekosistemlerdeki küresel bakteri dağılımı çalışmasının, mikrobiyal toplulukların yatay ve dikey olarak haritalanmasını, mikrobiyal çeşitliliğin bölgesel resminin çizilmesini ve sucul ekosistemlerdeki biyocoğrafik bakteri biyomlarını tanımlayan dağılım modellerinin başlatılmasını sağladığını göstermektedir.

3.2.2 Makro organizmaların eDNA’sı

Makroorganizmalardan elde edilen eDNA, mikroorganizmaların eDNA’sından doğası gereği farklıdır. Mikrobiyal eDNA bir numunedeki tüm canlı organizmaları temsil ederken, bir numunedeki mikroorganizmadan elde edilen eDNA sadece organizma içermeyen DNA ve hücresel kalıntıların bir kısmına karşılık gelir.

Makroorganizmaların eDNA’sının keşfi ve incelenmesi, biyoçeşitliliğin korunması amaçlarına uygundur ve hem modern hem de eski farklı karasal ve sucul ortamlara uygulanır. Örnek doğasının yanı sıra, eDNA çalışmalarının iş akışı aşağıdaki temel adımları kapsar (Şekil 1.1.):

Çevre (modern veya antik) seçimi;
Örnekleme;
İlgili çevresel örneğe özgü prosedür boyunca DNA ekstraksiyonu;
Biyoçeşitliliği ortaya çıkarmak için jenerik/türlere özgü primerler yardımıyla PCR amplifikasyonu;
Amplikon dizilimi;
Biyoinformatik veri işleme;
Türlerin tanımlanması ve sonuçların yorumlanması.

Antik çevrelerde biyoçeşitlilik değerlendirmesi

Eski ortamlar karasal ve sucul sedimentlerden oluşmaktadır. Bu sedimentler, makroorganizmaların biyoçeşitliliğinin değerlendirilmesi için eDNA’nın çıkarıldığı ve incelendiği ilk sedimentlerdir. Eski ekosistemlerdeki eDNA yaklaşımının başarıları, geçmiş biyoçeşitliliğin tanımlanmasına katkıda bulunmakta ve makroorganizmaların evrim tarihine ışık tutmaktadır. Dahası, eski ortamların eDNA’sı popülasyon demografisinin zaman çerçevesini değiştirebilir ve yok olma tahminlerinin daha güvenilir olmasına katkıda bulunabilir. Bu daha güvenilir değerlendirmeler de daha iyi koruma stratejilerinin tasarlanmasına ve uygulanmasına yardımcı olabilir. Deri hücreleri, dışkı veya idrardan elde edilen eDNA, soyu tükenmiş türlerin son ortaya çıkış tarihleri için bir destek kanıtı olarak hizmet edebilir.

Bu çalışmaların başlıca kazanımları Tablo 1.1’de özetlenmiştir.

Figure 1.1. eDNA studies flowchart. (Source: Thomsen & Willerslev, 2015)

Tablo 1.1. Antik çevrelerde biyoçeşitlilik değerlendirmesi.

eDNA Türü	Örnekler/Karakteristikler	Uygulamalar
Sedimentler
Karasal sedimentler
– Sedimentel antik DNA (sedaDNA)	– Lokal orijinli permafrost örnekleri – Numunede bulunan dışkı, idrar, epidermal hücreler ve organizmaların (memeliler, omurgasızlar, kuşlar, bitkiler) saç kalıntılarından elde edilir	– Paleo-ekosistemlerin yeniden yapılandırılması ve eski bitki ve hayvan topluluklarının tür zenginliğinin gösterilmesi
– Tabakalar boyunca DNA liçing	– Donmamış çökellerin tabakaları arasında
Sucul sedimentler
– Deniz eDNA’sı	– Okyanuslardaki en büyük eDNA rezervuarı – Anoksijenik koşullar eDNA’yı korumuş ve nükleaz kaynaklı bozulmayı azaltmıştır	– Deniz ekosistemleri üzerindeki antropojenik etkinin değerlendirilmesi için uygulanır; – Mikro coğrafi bölgelerdeki tür çeşitliliğini ortaya çıkarmak için YND kullanımı
– Estuarin eDNA	– Ökaryot topluluklarının karşılaştırılması için kullanışlıdır
– Tatlı su eDNA’sı	– Tatlı su sediman türlerinin (bitki kökenli eDNA’ya dayalı) taksonomik temsili ile ilgili makrofosillerinki arasında kanıtlanmış eşleşme	– Biyoçeşitliliğin daha iyi ortaya çıkarılması için makrofosil ve polen analizlerinin tamamlanması – Çevresel değişikliklerin ekolojik ve evrimsel sonuçlarının daha iyi anlaşılması
Buzullar
– eDNA	– Yerel ve uzak kökenli antik buz çekirdekleri	– Geçmiş ekosistemlerin bitki ve hayvanları hakkında bilgi sağlar

Modern ortamlarda biyoçeşitlilik değerlendirmesi

Modern ekosistemlerde biyoçeşitlilik değerlendirmesi, karmaşık tür topluluklarının yapısını ve işlevini anlamak için çok önemlidir. Normal ve çevresel dalgalanmalar ve homeostaz bozukluğu altında ekosistemlerin sağlığını ve dinamiklerini ölçmeye yardımcı olur.

Çeşitli ortamlarda makroorganizmaların biyoçeşitliliğinin değerlendirilmesinde kullanılan temel yaklaşımlar ve sonuçları Tablo 1.2’de özetlenmiştir.

Tablo 1.2. Modern ortamlarda biyoçeşitlilik değerlendirmesi.

eDNA Türü	Örnekler/Karakteristikler	Uygulamalar
Karasal habitatlar
Yüzey toprağı
– Hücre içi/ hücre dışı eDNA	– eDNA metabarkodlama	– Tür topluluklarının zenginliğini ve çeşitliliğini ortaya çıkarır – YND tarafından tanımlanan ekosistem sağlığı biyo-gösterge gruplarını kullanır – Genel taksonomik zenginliği ve bireysel türlerin göreli biyokütlesini yansıtır
Sucul habitatlar
Tatlı su
– Makro organizmalardan eDNA	– Hızlı eDNA bozunması türlerin ve popülasyonların günümüzdeki varlığını kanıtlaması	– Koruma yaklaşımlarına uygulama – İstilacı türlerin tespiti – Düşük bolluktaki türlerin varlığı – Tehlike altındaki türlerin izlenmesi (göreceli bolluk tahmini) – Biyokütle ve tür kompozisyonunun ölçülmesi
Deniz suyu
– Makro organizmalardan eDNA	– eDNA metabarkodlama	– Deniz biyoçeşitliliğinin ve kaynaklarının izlenmesi ve yönetimi

4. eDNA ÖRNEKLEME

4.1. eDNA protokollerinin geliştirilmesi

Örnekleme

Hedeflenen ortam ne olursa olsun (karasal veya sucul, eski veya çağdaş), eDNA iş akışındaki ilk adım örneklemedir.

Su örneklemesi: su örneklerinin doğrudan kaynaktan veya çeşitli malzemelerden (selüloz-nitrat, cam elyaf veya karbonat) filtrelerden süzüldükten sonra toplanması ve korunması (etanol veya Na-asetat ile). Doğrudan numunenin derhal dondurulması gerekir ve filtre bazlı olanlar – filtre matrisinin etanol ile dondurulması veya dehidrasyonu.

Toprak örneklemesi: yüzey toprağı örnekleri toplanır ve polietilen steril torbalarda kapatılır ve -80 ^oC’de dondurulmadan önce işlenmek üzere 4^oC’de saklanır. Bunun yanı sıra, kimyasal bileşim ve özellikleri (organik madde varlığı, temel ve temel olmayan elementler) ve mevcut organizmalar (mikroskobik gözlem) hakkında veri sağlamak için aynı sahadan alınan toprak örneklerinin biyokimyasal analizleri yapılır.

DNA ekstraksiyonu

eDNA, ilgili çevresel numune göz önünde bulundurularak iyi bilinen son teknoloji protokoller ve kitler izlenerek izole edilir. Örneklerden ekstrakte edildikten sonra eDNA saflaştırılır ve dondurularak muhafaza edilirse stabildir. Sonucu tehlikeye atabilecek önemli bir konu, türler arasında varsayılan çapraz kontaminasyondur. Bu nedenle numune saklama ve eDNA ekstraksiyon prosedürlerinde dikkatli olunması gerekir.

PCR amplifikasyonu

eDNA geleneksel PCR yöntemleriyle analiz edilebilse de, daha hassas olmaları, çapraz amplifikasyon yapmamaları ve yanlış pozitif reaksiyonlar vermemeleri nedeniyle kantitatif PCR (qPCR) tercih edilen araçtır. qPCR’deki en önemli adım primer ve prob tasarımıdır.

Primerler iki farklı yaklaşımı karşılayacak şekilde tasarlanmıştır: türe özgü bir DNA bölgesini hedefleyen tek tür yaklaşımı ve belirli bir (çok taksonlu) organizma grubu için genel primerler kullanan çok tür yaklaşımı. Her iki durumda da prob, kantitatif bilgi sağlamak için kullanılır.

qPCR için türe özgü primerlerin ve probların tasarımı, iyi bilinen bir DNA bölgesindeki tüm tür değişkenliğini içeren kapsayıcı bir konsensüs dizisinin birleştirilmesini içerir. Makroorganizmalar için, mtDNA nükleerden daha bol olduğu için tercih edilir. Ayrıca adresinde GenBank’ta daha fazla dizi verisi bulunmaktadır. Yaklaşık 100 (90-120) bps’lik hedef segmentin amplifikasyonunu sağlayan ileri ve geri primerler ve prob üretimi için qPCR primer yazılım uygulaması önerilir. GenBank veri tabanı ile tasarlanan primerler ve prob, diğer türlerle çapraz amplifikasyonu önlemek için iki kez kontrol edilmelidir

Amplikon dizileme

qPCR tarafından üretilen amplikonlar dizileme işlemine tabi tutulur. Birinci nesil dizilemeden Yeni nesil dizilemeye kadar, DNA dizileme yaklaşımları ve platformları muazzam bir teknolojik gelişim geçirmiştir. Şekil 1.2’de sunulan bu metodolojik yaklaşım ilerlemesinin tarihçesi:

Birinci nesil dizileme (BND) – Sanger’in shotgun teknolojisi yaklaşımı. BND, uzun DNA parçalarında (700 ve 1000 bps) yüksek doğruluk sunan altın dizileme standardıdır. Ancak, bir seferde yalnızca bir matris zinciri tespit edilebildiği için yavaş ve zaman alıcı bir yöntemdir.
İkinci nesil dizileme (İND) – PCR tekniklerine dayanır;
Üçüncü nesil dizileme (ÜND) – tek moleküllü dizileme teknolojisine (TMD) dayalı de novo TMD ‘nin NANOPORE SEKANSLAMA türü, molekülleri (teker teker) sekanslama için nanogözeneklerden geçirmek üzere elektroforezi kullanır.
Yeni nesil dizileme (YND), hedef DNA bölgelerinin derin dizilemesi ve yüksek sonuç hassasiyeti ile birlikte dizileme işleminin yüksek hızını ve ölçeklenebilirliğini sunan büyük ölçüde paralel bir dizileme teknolojisidir. YND, geleneksel Sanger dizileme yaklaşımına göre daha az zaman alıcı ve daha ucuzdur. YND, sentez yoluyla dizileme (SBS, ILLUMINA) ve ligasyon yoluyla dizileme (SBL, ROCHE 454) teknolojilerini kullanır. Bir SBL modifikasyonu, tespit doğruluğu diğer YND yöntemlerinden bile daha yüksek olan oligonükleotid ligasyonu ve tespiti (SOLiD, ABI SOLID) ile dizilemedir. Yarı iletken çip teknolojisi, ana avantajı düşük maliyeti olan iyon torrent dizilemesine (ION TORRENT) dayanmaktadır.

Şekil. 1.2. DNA dizileme teknolojileri ve platformları (Kaynak: Zhang vd., 2021).

Dizilenmiş verilerin biyoinformatik olarak işlenmesi, türlerin tanımlanması ve sonuçların yorumlanması

YND teknolojisi, makine destekli işleme ve analiz gerektiren büyük miktarlarda DNA dizileme verisi üretir. Burada, biyoinformatiğin in silico yaklaşımı, dizi sıralama, hata düzeltme ve organizmaların çeşitli taksonomik düzeylerde kümelenmesine veya taksonun bilinmemesi veya DNA veritabanı kapsamının zayıf olması durumunda Moleküler İşlemler Taksonomik Birimlerine (MİTB’ler) yardımcı olur. Biyoinformatik yaklaşım, genleri, operonları ve fonksiyonel RNA’ları tahmin eden elde edilen dizilerin fonksiyonel ek açıklamasına yardımcı olur. Protein dizisi tahmini, halihazırda var olan gruplara üye eklenmesine, yeni ortolog grupların oluşturulmasına ve farklı ortolog gruplara daha kesin proteinlerin eşlenmesine izin verir. Bu yaklaşım, çeşitli ortamlardan gelen bağımsız eDNA örneklerinin kodladıkları proteinlere dayalı olarak benzer işlevsel profillere sahip olup olmadığını belirler

Protokolün hataya açık adımları

Örnekleme. Hedef tür, örnekleme zamanını belirler. Bireyin geçmişine veya davranışına bağlıdır ve eDNA örneği içindeki hedef DNA’nın nitel temsilini ve niceliğini tehlikeye atmamak için dikkatlice seçilmelidir.
Prosedür tasarımı. Test tasarımı hem tür içi hem de türler arası varyasyonları dikkate almalıdır. Bir hedef türün tüm genetik varyasyon kümesi kapsanmazsa, bu yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Aksine, birlikte bulunan ve genetik olarak ilişkili türlerdeki genetik varyasyonların tamamı kapsanmazsa, yanlış pozitif bir sonuç kaydedilebilir. Bu nedenle, hem hedef hem de hedef olmayan ilgili türler için mevcut genetik bilgiyi kapsayan bir genetik bölge seçmek çok önemlidir. Bu nedenle, tahlil, riskli sonuçları en aza indirecek kadar hassas ve spesifik olmalıdır.
Proses kalitesinin kontrolü. Tahlil, sonuçların dahili doğrulaması ve kalite güvencesi için uygun pozitif ve negatif kontrolleri içermelidir. Bu kontroller tüm proses aşamalarını kapsamalıdır:
- DNA ekstraksiyonu – ekstraktlar arasındaki çapraz kontaminasyonu tespit etmek için negatif bir kontrol;
- PCR amplifikasyonu – reaksiyon inhibisyonu için sinyal vermek üzere her kuyu için dahili pozitif kontrol; başka DNA örneklerinin işlenmediği bir laboratuvarda eDNA ekstraksiyonu ve qPCR performansı;
- Bozulmuş ve düşük kaliteli DNA örnekleri, yanlış pozitif sonuçlardan kaçınmak için üç kopya halinde yapılmalıdır;
- Örnek sonuç aralığını genişletmek bir hedef türün farklı örneklerinden elde edilen DNA için standart eğriler geliştirilmelidir;
- Proses kontrolleri: hedef türlerin aralığı dışındaki türleri içeren bir negatif kontrol ve damıtılmış sudan alınan örnekleri içeren bir negatif kontrol; steril sarf malzemeleri ve cam eşyaların kullanılması.
Tespit doğruluğu. Belirsizlikten kaçınmak ve her tür için bilinmeyen ve tür boyutları, yoğunluk, davranış, çevresel habitat gibi çeşitli faktörlere göre değişen alt tespit sınırlarını belirlemek için tekrarlanan örneklere ihtiyaç vardır.

4.2. Teknik zorluklar ve dezavantajlar

4.2.1. eDNA elde etme ve dizilemedeki dezavantajlar

eDNA’nın bu uygulamaları tartışılmaz olsa da, sorunlu olduğu ve yanlış yorumlanmış veya güvenilmez sonuçların kaynağı olduğu düşünülen birkaç konu vardır. Başlıca güçlükler, ortaya çıkardıkları sorunlar ve bunların çözümüne yönelik yaklaşımlar Tablo 1.3’te özetlenmiştir.

Tablo 1.3. eDNA’nın temel teknik tuzakları ve bunların çözüm yaklaşımları.

Sorun	Sorunlu konu	Eliminasyon yaklaşımı
Kirlenme	– Olası kontaminasyon yolları: örnekleme, tüm laboratuvar analizleri – Çapraz kontaminasyon: farklı bölgelerden gelen karışık DNA’lar – DNA kopyalarının tüm laboratuvara yayılması – Yanlış pozitif sonuçlar	– Bir örnekte elde edilen dizilerin sayısını en aza indirin – Tek ve aynı amplifikasyon başarısını elde etmek için bağımsız PCR reaksiyonları gerçekleştirin – PCR öncesi ve PCR sonrası süreçleri fiziksel olarak ayırın – Örnekleme, DNA ekstraksiyonu ve PCR adımları için boşlukları dahil edin
Enzim inhibisyonu	– DNA ve hümik maddelerin birlikte ekstraksiyonu Taq Polimeraz inhibisyonuna yol açar – Yanlış negatif profillerin oluşturulması	– Hümik asit ekstraksiyonundan kaçının
PCR ve dizileme kaynaklı hatalar	– Nokta mutasyonları ve kimerik molekül oluşumu – Sekanslama sırasında yanlış pozitifler	– Ham dizileme verilerini filtreleme ve sinyallerin ‘denoising’ işlemini uygulama – Hata düzeltme ve mümkün olduğunca çok sıralama bilgisinin saklama
Sonuçların zamansal ve özel tutarlılığı	– Farklı habitatlardan elde edilen eDNA bozunma süresi birkaç günden yüzyıllara kadar değişmektedir bu da sonuçların zamansal ve özel tutarlılığının düşük olmasına neden olmaktadır – eDNA’nın (çoğunlukla sucul) ekosistemler içinde taşınması	– Sonuçların mekansal ve zamansal ölçekte dikkatli bir şekilde yorumlanması
eDNA uygulaması	– Tek tür yaklaşımı – her seferinde yalnızca bir türü tespit eder – Çoklu tür yaklaşımı (DNA metabarkodlama) – belirli dizilerin (türlerin) diğerlerine (türlere) göre daha az verimli amplifikasyonu – qPCR kantifikasyonunun güvenilirliği – arka plandan gerçek pozitiflerin tanımlanması – eDNA’nın düşük taksonomik çözünürlüğe sahip kısa dizilerle sınırlandırılması nedeniyle DNA dizisi çeşitliliğinin tür çeşitliliğine dönüştürülmesindeki zorluklar	– Metabarkodlama amacıyla jenerik primerlerin optimizasyonu – Standartlaştırılmış sayıda qPCR replikası kullanılması – DNA üretimi ve bozunması için model kalıpların oluşturulması – DNA dizisi veritabanlarındaki boşlukların doldurulması – Metabarkodlama verilerinden dizilerin kümelenmesinin standartlaştırılması

4.2.2. Veri yorumlama zorlukları

eDNA çalışma sonuçlarının yorumlanması sağlam bir eleştirel yaklaşım gerektirmektedir. eDNA verilerinin yorumlanmasındaki temel zorluklar, ölü ve canlı organizmalar, belirli yaşam evreleri (karmaşık yaşam döngülerine sahip hayvanlar için) ve melez türler (melez bir türde yalnızca anne soyunu tespit eden mtDNA kullanımı nedeniyle) arasında fark gözetmeyen eDNA tespit yöntemleriyle ilgilidir. Öte yandan eDNA, belirli bir tür tarafından kullanılan toplam alan sayısının sadece bir kısmını tespit eder. Bu anlamda, eDNA verilerine göre türlerin doluluğuna ilişkin güvenilir tahminlere ihtiyaç vardır.

eDNA verilerinin yorumlanmasındaki teknik zorluklar, özellikle biyoçeşitliliğin temsili ve korunmasıyla ilgili olanlar olmak üzere, eDNA çalışmalarının sonuçlarının doğrulanması için standart genel protokollerin hazırlanmasıyla ilgili bir başka sorunu da beraberinde getirmektedir.

5. eDNA uygulama potansiyeli

5.1. eDNA tespit yöntemlerinin ve protokollerinin iyileştirilmesi

Yukarıda belirtilen sorunlar ve dezavantajlarla etkin bir şekilde mücadele etmek için eDNA yöntemlerinin ve protokollerinin temel olarak geliştirilmesi, biyolojik çeşitliliğin izlenmesi için karasal ve sucul ekosistemlerde eDNA’nın gelecekteki araştırmalarının aşağıdaki ana konulara odaklanmasını gerektirmektedir.

Türlerin yer ve zamandaki kalıcılığının etkili bir şekilde izlenmesini sağlamak için çeşitli habitatlarda eDNA’nın mekansal ve zamansal dağılımının incelenmesi;
Bireysel yoğunluk veya toplam biyokütle varlığı hakkında güvenilir sonuçlara varılmasını sağlamak için eDNA miktarı ve tür bolluğu arasında daha iyi temsil edilen bağlantıların kurulması;
Tür bolluğu yorumlamasındaki hataları en aza indirmek için eDNA kaynağının kesin olarak belirlenmesi;
eDNA kullanılabilirliğini ve bozulma oranlarını etkileyen abiyotik faktörlerin (T ^oC, pH, tuzluluk, UV radyasyonu) etkisinin hesaba katılması;
Daha uzun DNA parçalarının elde edilmesi, nükleer genlerin hedeflenmesi ve eDNA metabarkodlamasının geniş ölçekte ve daha karmaşık ekosistemlerde kullanılması gibi teknik iyileştirmelerin uygulanması.

5.2. Biyoçeşitlilik envanter ve izleme aracı olarak eDNA uygulamasındaki gelişmeler

eDNA teknolojisi, biyolojik çeşitliliğin izlenmesi için geleneksel yaklaşımlara kıyasla önemli avantajlar sunmaktadır. Metodolojik ilerlemesi aşağıdaki temel özellikleri içermektedir

eDNA protokolünün standartlaştırılmış koşulları: örneklemeden dizileme verilerinin yorumlanmasına kadar;
Non invasiv özelliği: eDNA teknolojisi, test edilen türler ve çevresel yaşam alanları için kesinlikle zararsızdır;
Mevsimsel, coğrafi konuma ve hava koşullarına bağlı olarak değişir;
Yüksek çözünürlüklü tespit. eDNA teknolojisi büyük bir hassasiyet ile karakterize edilir. Türleri yakın akraba muadillerinden ayırt etmek ve tanımlamak zor olduğunda, yöntemlerinin geleneksel yöntemlerden daha iyi olduğu kanıtlanmıştır.
Uygun maliyet-değer oranı. eDNA, geleneksel biyoçeşitlilik izleme yaklaşımlarına göre daha kısa kullanım süresi ve daha düşük maliyet sunar. eDNA metabarkodlama yaklaşımı, YND ödüllerinin azalmasıyla birlikte geleneksel yöntemlere göre giderek daha üstün hale gelmektedir;
Yeni nesil gerçek zamanlı dizileme teknolojileri ve spektroskopik yöntemlerin ortaya çıkmasıdır.

6. KAYNAKLAR

Andersen, K., Bird, K.L., Rasmussen, M., Haile, J., Breuning-Madsen, H., Kjaer, K.H., Orlando, L., Gilbert, M.T.P., Willerslev, E. (2012). Meta-barcoding of ‘‘dirt’’ DNA from soil reflects vertebrate biodiversity. Mol. Ecol. 21, 1966–1979. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-294X.2011.05261.x.

Anderson, I.C., Cairney, J.W.G. (2004). Diversity and ecology of soil fungal communities: increased understanding through the application of molecular techniques. Environ. Microbiol. 6, 769–779. http://dx.doi.org/10.1111/j.1462-2920.2004.00675.x.

Baird, D.J., Hajibabaei, M., 2012. Biomonitoring 2.0: a new paradigm in ecosystem assessment made possible by next-generation DNA sequencing. Mol. Ecol. 21, 2039–2044.

Barnes, M.A., Turner, C.R., Jerde, C.L., Renshaw, M.A., Chadderton, W.L., Lodge, D.M. (2014). Environmental conditions influence eDNA persistence in aquatic systems. Environ. Sci. Technol. 48, 1819–1827. http://dx.doi.org/10.1021/es404734p.

Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J.A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl, M.W., Shipley, G.L., Vandersompele, J., Wittwer, C.T. (2009). The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of QuantitativeReal-Time PCR Experiments. Clin Chem. 55, 611–622.

Caporaso, J.G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F.D., Costello, E.K., Fierer, et al. (2010). QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 7, 335–336. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.f.303.

Coissac, E., Riaz, T., Puillandre, N. (2012). Bioinformatic challenges for DNA metabarcoding of plants and animals. Mol. Ecol. 21, 1834–1847. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-294X.2012.05550.x.

Darling, J.A., Mahon, A.R. (2011). From molecules to management: adopting DNAbased methods for monitoring biological invasions in aquatic environments. Environ. Res. 111, 978–988. http://dx.doi.org/10.1016/j.envres.2011.02.001

Deiner, K., Walser, J.-C., Mächler, E., Altermatt, F. (2015). Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Cons. 183, 53–63.

Dejean, T., Valentini, A., Duparc, A., Pellier-Cuit, S., Pompanon, F., Taberlet, P., Miaud, C. (2011). Persistence of environmental DNA in freshwater ecosystems. PLoS ONE 6, e23398. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0023398.

Egan, S.P., Barnes, M.A., Hwang, C.-T., Mahon, A.R., Feder, J.L., Ruggiero, S.T., Tanner, C.E., Lodge, D.M. (2013). Rapid Invasive species detection by combining environmental DNA with light transmission spectroscopy: eDNA-LTS species detection. Conserv. Lett. 6, 402–409. http://dx.doi.org/10.1111/conl.12017.

Faure, D. and Joly D., 2016. Insight on Environmental Genomics. High-throughput Sequencing. Elsevier Ltd., https://doi.org/10.1016/C2015-0-06337-7

Ficetola, G.F., Miaud, Claude, Pompanon, François, and Taberlet, Pierre, 2008, Species detection using environmental DNA from water samples: Biology Letters, v. 4, p. 423–425, doi:10.1098/rsbl.2008.0118.

Haile, J., Holdaway, R., Oliver, K., Bunce, M., Gilbert, M.T.P., Nielsen, R., Munch, K., Ho, S.Y.W., Shapiro, B., Willerslev, E. (2007). Ancient DNA chronology within sediment deposits: are paleobiological reconstructions possible and is DNA leaching a factor? Mol. Biol. Evol. 24, 982–989. http://dx.doi.org/10.1093/molbev/msm016.

Herder, J.E., Valentini, A., Bellemain, E., Dejean, T., van Delft, J.J.C.W., Thomsen, P.F., Taberlet, P. (2014). Environmental DNA – a review of the possible applications for the detection of (invasive) species. Stichting RAVON, Nijmegen, Report 2013-104.

Kelly, R.P., Port, J.A., Yamahara, K.M., Martone, R.G., Lowell, N., Thomsen, P.F., Mach, M.E., Bennett, M., Prahler, E., Caldwell, M.R., Crowder, L.B., 2014b. Harnessing DNA to improve environmental management. Science 344, 1455–1456. http://dx.doi.org/10.1126/science.1251156

Taberlet, P., Coissac, E., Hajibabaei, M., Rieseberg, L.H., 2012a. Environmental DNA. Mol. Ecol. 21, 1789–1793.

Taberlet, P., Coissac, E., Pompanon, F., Brochmann, C., Willerslev, E., 2012b. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 21, 2045–2050.

Thomsen P.F. and Willerslev E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biological Conservation 183 (2015) 4–18

Zhang L, Chen F, Zeng Z, Xu M, Sun F, Yang L, Bi X, Lin Y, Gao Y, Hao H, Yi W, Li M and Xie Y (2021) Advances in Metagenomics and Its Application in Environmental Microorganisms. Front. Microbiol. 12:766364. doi: 10.3389/fmicb.2021.766364