Modulo 1 – Genómica: ADN ambiental y muestreo

1. INTRODUCCIÓN

El muestreo, la extracción y el análisis del ADN que persiste en el medio ambiente es una de las innovaciones tecnológicas y científicas más esenciales de la última década. La obtención de ADN a partir de muestras ambientales, el llamado ADN ambiental (eADN), es un poderoso método para obtener información sobre especies, poblaciones y comunidades, independientemente de su presencia física en la naturaleza como individuos o como microorganismos cultivables. La persistencia del ADN en el medio ambiente y el hecho de que pueda ser muestreado, extraído y analizado se consideran avances científicos y tecnológicos esenciales de nuestro tiempo relacionados con el seguimiento de las especies y el inventario de sus hábitats naturales. Así pues, el ADNe arroja luz sobre la investigación fundamental y aplicada en biología molecular, ciencias medioambientales, ecología, paleontología, etc.

Utilizando ADNe de una sola muestra, se puede analizar simultáneamente el ADN de toda una comunidad microbiana compuesta por diferentes categorías taxonómicas. El análisis consiste en la amplificación por PCR del ADNe seguida de la secuenciación del ADN. La amplificación se organiza mediante un enfoque monoespecífico o multi-específico que explota cebadores específicos de especie y genéricos para un determinado grupo objetivo de organismos.

La tecnología de alto rendimiento de la secuenciación de próxima generación (NGS) avanza rápidamente en la actualidad y contribuye a la realización de estudios exhaustivos basados en el enfoque multi-específico del ADNe. Dado que la aplicación de esta tecnología está en expansión, ofrece una ventaja sustancial en la relación coste-valor en comparación con los métodos clásicos de secuenciación. Además, el enfoque de ADNe multi-específico está ganando popularidad progresivamente gracias al desarrollo de la técnica de metabarcodificación del ADN. La metabarcodificación del ADN consiste en el uso de la secuenciación masiva del ADN para la identificación simultánea a nivel molecular de múltiples taxones en una muestra medioambiental. Las secuencias diana amplificadas por PCR, secuenciadas y aplicadas como códigos de barras para encontrar taxones discriminatorios, suelen ser las de genes altamente informativos a nivel de especie y presentes en un elevado número de copias.

La aplicación de enfoques basados en el ADNe para describir la biodiversidad de organismos de ecosistemas antiguos y contemporáneos mediante la obtención de material genético directamente del medio ambiente es un antecedente sobre el que pueden aplicarse diversas metodologías moleculares y herramientas analíticas para revelar todo el potencial de la rama de la biología molecular de la genómica ambiental.

2. LA GENÓMICA DE UN VISTAZO: ENFOQUE BASADO EN EL ADN PARA LA GENERACIÓN E INTERPRETACIÓN DE DATOS GENÓMICOS

La genómica es una biociencia que analiza las interacciones de los genes como objetos de información biológica a nivel de especie, población y ecosistema. Se ocupa de vastos conjuntos de información genética y la analiza automáticamente mediante conceptos de red con ayuda de tecnologías informáticas y bioinformáticas de alto rendimiento.

Como enfoque basado en el ADN para la generación e interpretación de datos genómicos, las raíces de la genómica se remontan a la década de 1970, cuando el grupo de Fred Sanger desarrolló un método de secuenciación de genes y con él completó los tres primeros genomas, los del bacteriófago Φ-X174, el genoma de la mitocondria humana y el genoma del virus λ. Dos años más tarde, el equipo de Walter Fiers determinó por primera vez la secuencia de un gen: el gen de la proteína de cubierta del bacteriófago MS2. Durante la misma década, el genoma del bacteriófago Φ-X174 fue el primer genoma de ADN completamente secuenciado, y casi 20 años después, en 1995, se secuenció el genoma del primer organismo de vida libre: el de la bacteria Hemophilus influenzae. Desde entonces, se han secuenciado a un ritmo vertiginoso los genomas de especies pertenecientes a los tres dominios de la vida: Archaea, Bacteria y Eukarya.

En la actualidad, la genómica se diferencia a su vez en varios subtipos en función del nivel en que opera y de los enfoques de identificación de genes que utiliza.

• Genómica funcional. Se ocupa del análisis de genes a nivel funcional. Los enfoques metodológicos incluyen dos enfoques genéticos, complementarios entre sí:
  • Metodología genética hacia delante (clásica) que engloba mutantes generados al azar del fenotipo deseado y los explota para encontrar la secuencia genética normal y su función;
  • La metodología de la genética inversa utiliza la secuencia genética normal (obtenida por genómica) e induce una mutación dirigida en ese gen para observar cómo esta mutación altera el fenotipo. A partir de esta alteración, se deduce la función del gen normal.
• Microarrays genómicos. Mejora la identificación de un subconjunto completo de genes que operan durante etapas temporales o de desarrollo específicas del crecimiento del organismo. El conjunto total de genes transcritos durante un acontecimiento de interés (por ejemplo, el crecimiento microbiano en presencia/ausencia de O2, el crecimiento del pelo de la raíz en una planta o la producción de yemas de las extremidades en un animal) puede determinarse mediante este enfoque. Aunque el objetivo de la genética hacia adelante es el mismo (un conjunto del subconjunto de genes referidos a un proceso o condiciones biológicas específicas), esta técnica identifica los genes para los que se inducen mutaciones, y su efecto fenotípico es fácilmente rastreable.

Genómica comparativa. Estudia las relaciones evolutivas entre organismos y contribuye a nuestro conocimiento de la filogenia de la vida. Metodológicamente, con la secuenciación de genomas completos, la genética comparada ofrece la detección de diferencias mucho más específicas y menores en los organismos y, por tanto, complementa los datos de la genética clásica (tamaño y número cromosómico y patrones de bandas entre poblaciones, géneros y especies) para las relaciones evolutivas. La principal ventaja de la genómica comparativa en este sentido es que compara directamente los ADN de los organismos a pequeña escala. Dado que las secuencias de ADN se procesan y miden mediante un enfoque matemático, el análisis genómico se cuantifica con precisión y puede medir grados específicos de parentesco.

Genómica ambiental. Integra los datos y metadatos ambientales acumulados en diversos niveles de organización de los organismos (de la célula al ecosistema). Esta rama de la ciencia favorece la interdisciplinariedad como filosofía y metodología para comprender la complejidad y las funciones de genes y organismos con su dinámica y evolución en contextos temporales y espaciales. Su objetivo es caracterizar a nivel genético los factores que contribuyen a la diversidad de respuestas de los organismos a los factores de estrés ambiental. Una de las herramientas más poderosas de la genómica ambiental es la identificación y el estudio de los genes que responden al medio ambiente en todas las especies para acelerar los descubrimientos de la ciencia de la salud ambiental.

3. ADN AMBIENTAL

3.1. Definición: El ADNe como herramienta para el seguimiento de especies, poblaciones y comunidades a nivel molecular

El ADNe, abreviatura de ADN ambiental, es el ADN nuclear o mitocondrial de un organismo liberado en el medio ambiente. El ADNe puede proceder de cualquier material celular. Las fuentes típicas de ADNe de los macroorganismos son la piel y el pelo desprendidos, la orina y los excrementos secretados, los cadáveres, las mucosas, los gametos y los individuos muertos. El ADNe de los microorganismos (tanto pro- como eucariotas) procede de un organismo entero. El ADNe puede encontrarse en cualquier lugar de los hábitats terrestres (suelo) o acuáticos (agua y sedimentos). Puede muestrearse, detectarse y controlarse mediante técnicas de biología molecular independientemente de la presencia de cualquier material biológico de origen. La persistencia del ADNe en la naturaleza es principalmente sensible a la temperatura. Puede conservarse desde unas pocas semanas en aguas templadas hasta cientos o miles de años en hábitats siempre congelados. En los hábitats acuáticos, la concentración de ADNe es muy baja y se dispersa fácilmente debido a los procesos hidrológicos. En los hábitats terrestres, las muestras de ADNe se enriquecen en el material diana en comparación con las acuáticas. Independientemente del hábitat, la exposición del ADNe a la radiación UV, la temperatura elevada, el pH bajo y las endo o exonucleasas puede provocar su rápida degradación.

Históricamente, el ADNe apareció con la idea de investigación para obtener ácidos nucleicos de microorganismos directamente del medio ambiente a finales de los años 80 del siglo XX. Fue la primera aproximación para obtener una imagen real de la abundancia microbiana en la naturaleza, ya que los métodos basados en cultivos para estudiar la diversidad microbiana tergiversan la situación en condiciones naturales. El ADNe se consideró la única herramienta que revelaba su representación genética y aportaba información sobre la diversidad microbiana y la genómica funcional.

Hoy en día, el ADNe se utiliza como herramienta para la detección de especies objetivo y la evaluación de la biodiversidad en los ecosistemas. Puede definirse como un método para obtener material genético del medio ambiente seguido de una diversidad de métodos y herramientas moleculares utilizados para el análisis con el fin de profundizar en aspectos fundamentales y aplicados del inventario y seguimiento de especies, la ecología, la biología de la conservación, la paleontología y las ciencias ambientales.

3.2. Ámbitos de aplicación del ADNe

3.2.1 eADN de origen microbiano en hábitats terrestres y acuáticos para el seguimiento de la biodiversidad

La metabarcodificación del ADN electrónico, como método emergente para la evaluación de la biodiversidad, consiste en tomar muestras del medio ambiente (acuático, terrestre o incluso aéreo), extraer ADN, amplificarlo mediante PCR con cebadores generales o universales y secuenciar el producto de la amplificación mediante NGS para generar una enorme cantidad de datos de secuenciación en bruto. Estos datos son la fuente de información valiosa sobre la presencia de especies definidas en una comunidad y la evaluación/seguimiento de su biodiversidad en todos los hábitats y grupos taxonómicos. Así pues, la metabarcodificación del ADNe es una herramienta esencial para la vigilancia ecológica y los estudios de conservación.

La metabarcodificación de ADNe como enfoque metodológico se caracteriza por su alta sensibilidad, selectividad taxonómica y rentabilidad, constituyendo una herramienta de biomonitorización eficaz y precisa. Durante casi una década, la metabarcodificación del ADNe se ha utilizado para la caracterización de hábitats acuáticos y terrestres a los que es difícil llegar con las herramientas tradicionales de vigilancia ecológica, no sólo para la composición de especies, sino también para la detección de la bioinvasión, el estudio de la ecología de las cadenas tróficas,  la identificación de especies crípticas, raras o amenazadas, la reconstrucción de ecosistemas antiguos y la vigilancia de la calidad del aire, el agua y el suelo.

Hábitats terrestres

A pesar del reto metodológico que supone la corta persistencia del ADNe en el suelo, la metabarcodificación del ADNe se utiliza para la detección de especies en ecosistemas terrestres. El ADNe se aplica para la caracterización de las comunidades microbianas de los ecosistemas terrestres, contribuyendo al estudio de su estructura y función. La anotación funcional de las proteínas predichas de diferentes hábitats terrestres y su asignación a varios grupos ortólogos permite estimar la abundancia o escasez de diversidad microbiana en estos mismos hábitats. Este análisis funcional, combinado con el análisis de conglomerados bidimensional, permite un estudio comparativo de los perfiles funcionales en términos de proteínas codificadas de hábitats terrestres relacionados y encontrar qué genes están particularmente enriquecidos o restringidos a un hábitat determinado. Todo ello permite a los investigadores predecir diferencias funcionales entre las comunidades microbianas. Además, este enfoque permite comprender las relaciones genotipo-fenotipo y construir modelos de dinámica de ecosistemas que arrojen luz sobre la biodiversidad microbiana global. La metabarcodificación de ADNe reduce los costes de muestreo de microorganismos, superando el obstáculo de los métodos dependientes de cultivos para el estudio de la abundancia de especies microbianas y sus repercusiones negativas.

La aplicación de la secuenciación shotgun de eDNA, aislado de diversos hábitats terrestres, combinada con el análisis cuantitativo del contenido génico, dio lugar a la generación de huellas microbianas específicas de cada hábitat. Estas huellas se atribuyen a entornos peculiares de las muestras y reflejan sus características específicas.

Por otro lado, la identificación de genes típicos de un entorno determinado mediante análisis comparativos centrados en genes revela nuevas perspectivas para interpretar y diagnosticar datos medioambientales. Así, la metabarcodificación del ADNe de muestras procedentes de regiones endémicas de patógenos microbianos puede utilizarse para detectar la presencia de patógenos y sus posibles organismos hospedadores, junto con los microbiomas asociados a la persistencia de estos patógenos en el medio ambiente. Además, la metabarcodificación del ADNe puede aplicarse al seguimiento y la vigilancia de patógenos. Puede emplearse en el diseño de sistemas para vigilar la interacción huésped-patógeno-medio ambiente y en la alerta temprana del riesgo de enfermedad antes de que ésta se manifieste.

La facilidad y universalidad de la aplicación de la metabarcodificación del ADNe se utilizan para observar y estudiar los hábitats amenazados de la Tierra mediante la detección de especies invasoras y la conservación de las que están en peligro.

Hábitats acuáticos

La dispersión relativamente rápida y la baja concentración del ADNe acuático hacen que los métodos tradicionales de evaluación de especies microbianas en muestras acuáticas constituyan un verdadero reto. Sin embargo, la medición de las comunidades microbianas dentro del agua dulce y marina mediante la metabarcodificación del ADNe a través de la generación de miles de secuencias de amplicones ayudó a detectar especies autóctonas (pequeñas o raras) de determinados hábitats acuáticos y a mejorar la evaluación de la biodiversidad. La metabarcodificación del ADNe ayuda a cuantificar las formas de vida microbiana tanto pro como eucariotas y a detectar especies existentes, describir otras nuevas y mejorar la comprensión general de la compleja dinámica microbiana de los ecosistemas acuáticos. Además, la metabarcodificación del ADNe puede utilizarse para la determinación de especies acuáticas invasoras. Esto se consigue aplicando procedimientos periódicos de cribado para la detección y seguimiento simultáneos de diversas especies invasoras.

Un profundo estudio de los amplicones de ARNr bacteriano de muestras que abarcan los hábitats acuáticos del océano global -desde la superficie hasta el fondo marino profundo- reveló las diferencias entre las comunidades microbianas pelágicas y bentónicas en todos los niveles taxonómicos. Se compararon la composición y la dinámica de las comunidades microbianas en aguas superficiales y profundas y en ecosistemas oxigenados/anoxigenados. Las diferencias establecidas reflejan la heterogeneidad y la dinámica de estos hábitats y las restricciones ambientales (por ejemplo, disponibilidad/falta de oxígeno, influencia terrestre, productividad de las aguas superficiales, calidad del agua, etc.) existentes en ellos. Todos estos datos indican que el estudio de la distribución bacteriana global en los ecosistemas acuáticos permite trazar mapas horizontales y verticales de las comunidades microbianas, dibujar el panorama regional de la diversidad microbiana y lanzar patrones de distribución que definen los biomas bacterianos biogeográficos en los ecosistemas acuáticos.

3.2.2 eADN de macroorganismos: evaluación de la biodiversidad en el contexto de la antigüedad y la modernidad

El ADNe extraído de macroorganismos difiere en su naturaleza del ADNe de los microorganismos. Mientras que el ADNe microbiano representa la totalidad de los organismos vivos de una muestra, el ADNe de un microorganismo de una muestra corresponde sólo a una parte de ADN libre de organismos y restos celulares.

El descubrimiento y estudio del ADNe de macroorganismos es apropiado para fines de conservación de la biodiversidad y se aplica a distintos entornos terrestres y acuáticos, tanto modernos como antiguos. Además de la naturaleza de la muestra, el flujo de trabajo de los estudios de ADNe abarca los siguientes pasos básicos (Fig. 1.1.):

• Selección del entorno (moderno o antiguo);
• Toma de muestras;
• Extracción de ADN según el procedimiento específico de la muestra medioambiental pertinente;
• Amplificación por PCR con ayuda de cebadores genéricos/específicos de la especie para revelar la biodiversidad;
• Secuenciación de amplicones;
• Procesamiento bioinformático de datos;
• Identificación de especies e interpretación de resultados.

Evaluación de la biodiversidad en entornos antiguos

Los ambientes antiguos comprenden sedimentos terrestres y acuáticos. Estos sedimentos fueron los primeros de los que se extrajo y estudió el ADNe para evaluar la biodiversidad de los macroorganismos. Los logros del enfoque del ADNe en ecosistemas antiguos contribuyen a describir la biodiversidad del pasado y arrojan luz sobre la historia de la evolución de los macroorganismos. Además, el ADNe de entornos antiguos puede modificar el marco temporal de la demografía de las poblaciones y contribuir a que las predicciones de extinción sean más fiables. Estas consideraciones más fiables, a su vez, pueden ayudar a diseñar y aplicar mejor las estrategias de conservación. El ADNe de células de la piel, heces u orina puede servir como prueba de apoyo a las fechas de última aparición del establecimiento de especies extinguidas.

Los principales logros de estos estudios se resumen en la Tabla 1.1.

Figura 1.1. Diagrama de flujo de los estudios de ADNe. (Thomsen & Willerslev, 2015)

Tabla 1.1. Evaluación de la biodiversidad en entornos antiguos.

Tipo de ADNe	Muestras/Características	Aplicaciones
Sedimentos
Sedimentos terrestres
– ADN sedimentario antiguo (sedaDNA)	– Muestras de permafrost de origen local – Derivadas de heces, orina, células epidérmicas y pelo de restos de organismos (mamíferos, invertebrados, aves, plantas) presentes en la muestra.	– Reconstrucción de paleo-ecosistemas y demostración de la riqueza de especies de antiguas comunidades vegetales y animales
– Lixiviación del ADN a través de los estratos	– Entre estratos de depósitos no congelados
Sedimentos acuáticos
– ADNe marino	– La mayor reserva de ADNe en los océanos – Las condiciones anoxigénicas preservaron el ADNe reduciendo la degradación impulsada por nucleasas	– Aplicado a la evaluación del impacto antropogénico en los ecosistemas marinos; – Uso de la NGS para revelar la diversidad de especies en regiones micro-geográficas.
– ADNe estuarino	– Útil para comparar conjuntos de eucariotas
– ADNe de agua dulce	– Coincidencia demostrada entre la representación taxonómica de las especies de sedimentos de agua dulce (basada en el ADNe de origen vegetal) y la de los macrofósiles pertinentes.	– Análisis complementarios de macrofósiles y pólenes para revelar mejor la biodiversidad – Una mejor comprensión de las consecuencias ecológicas y evolutivas de los cambios medioambientales
Glaciers
– ADNe	– Núcleos de hielo antiguos de origen local y lejano	– Proporciona información sobre las plantas y animales de los ecosistemas del pasado

 

Evaluación de la biodiversidad en entornos modernos

La evaluación de la biodiversidad en los ecosistemas modernos es crucial para comprender la estructura y función de los complejos conjuntos de especies. Ayuda a medir la salud y la dinámica de los ecosistemas en condiciones normales y bajo fluctuaciones ambientales y alteraciones de la homeostasis.

En la Tabla 1.2 se resumen los principales enfoques y resultados de la evaluación de la biodiversidad de macroorganismos en diversos entornos.

Tabla 1.2. Evaluación de la biodiversidad en entornos modernos.

Tipo de ADNe	Muestras/Características	Aplicaciones
Hábitats terrestres
Suelo superficial
– – Intra/extracellular ADNe	– ADNe metabarcoding	– Revela la riqueza y diversidad de las comunidades de especies – Explota grupos bio-indicadores de la salud de los ecosistemas, identificados por NGS – Refleja la riqueza taxonómica global y la biomasa relativa de las especies individuales
Hábitats acuáticos
Agua dulce
– ADNe de macroorganismos	– La rápida descomposición del ADNe demuestra la presencia contemporánea de especies y poblaciones	– Aplicación a planteamientos de conservación – Detección de especies invasoras – Presencia de especies poco abundantes – Seguimiento de especies amenazadas (estimación de la abundancia relativa) – Cuantificación de la biomasa y la composición de las especies
Agua del mar
– ADNe de macroorganismos	– ADNe metabarcoding	– Seguimiento y gestión de la biodiversidad y los recursos marinos

 

4. MUESTREO DE ADNe PARA SEGUIR LA DISTRIBUCIÓN DE LAS ESPECIES

4.1. Desarrollo de protocolos de ADNe

Muestreo

Sea cual sea el medio elegido (terrestre o acuático, antiguo o contemporáneo), el primer paso en el flujo de trabajo del ADNe es el muestreo.

Muestreo de agua: recogida y conservación (con etanol o Na-acetato) de muestras de agua directamente de la fuente o tras su filtración a través de filtros de diversos materiales (celulosa-nitrato, fibra de vidrio o carbonato). Las muestras directas requieren congelación inmediata, y las filtradas, congelación o deshidratación de la matriz del filtro con etanol.

Muestreo de suelos: las muestras de suelos superficiales se recogen y sellan en bolsas estériles de polietileno y se almacenan a 4^oC para su procesamiento antes de congelarlas a -80^oC. Paralelamente, se realizan análisis bioquímicos de las muestras de suelo del mismo lugar para obtener datos sobre su composición química y sus características (presencia de materia orgánica, elementos esenciales y no esenciales), así como de los organismos presentes (observación microscópica).

Extracción de ADN

El ADNe se aísla siguiendo protocolos y kits de última generación bien conocidos, teniendo en cuenta la muestra ambiental pertinente. Una vez extraído de las muestras, el ADNe es estable si se purifica y conserva mediante congelación. Una cuestión importante que puede poner en peligro los resultados es la posible contaminación cruzada entre especies. Por ello, es necesario tener precaución en el almacenamiento de las muestras y en los procedimientos de extracción del ADNe.

Amplificación PCR

Aunque el ADNe puede analizarse mediante métodos de PCR convencionales, la PCR cuantitativa (qPCR) es la herramienta preferida, ya que es más sensible, no produce amplificación cruzada y no da reacciones falsas positivas. El paso crucial en la qPCR es el diseño de los cebadores y las sondas.

Los cebadores se diseñan para satisfacer los dos enfoques distintos: el enfoque monoespecífico dirigido a una región de ADN específica de la especie y el enfoque multiespecífico que utiliza cebadores genéricos para un grupo determinado (multitaxón) de organismos. En ambos casos, la sonda se utiliza para proporcionar información cuantitativa.

El diseño de cebadores y sondas específicos de cada especie para la qPCR comprende el ensamblaje de una secuencia consenso inclusiva que contenga toda la variabilidad de la especie en una región de ADN bien conocida. En el caso de los macroorganismos, se prefiere el ADNmt por ser más abundante que el nuclear. Además, hay más datos de secuencias en GenBank. Se recomienda la aplicación de software qPCR primer para la generación de los cebadores “forward y reverse” y la sonda, que permite la amplificación del segmento diana de unos 100 (90-120) bps. Los cebadores y la sonda diseñados con la base de datos GenBank deben comprobarse dos veces para evitar la amplificación cruzada con otras especies.

Secuenciación de amplicones

Los amplicones generados por la qPCR se someten a secuenciación. Desde la secuenciación de primera generación hasta la secuenciación de próxima generación, los enfoques y plataformas de secuenciación del ADN han experimentado un enorme desarrollo tecnológico. La historia del avance de este enfoque metodológico, que se presenta en la Fig. 1.2. abarca los:

• Secuenciación de primera generación (FGS): el enfoque de la tecnología shotgun de Sanger. FGS es el estándar de secuenciación de oro que ofrece una alta precisión de fragmentos largos de ADN (700 y 1000 bps). Sin embargo, es un método lento y laborioso, ya que sólo puede detectarse una cadena matriz cada vez.
• Secuenciación de segunda generación (SGS)- basada en las técnicas PCR;
• Secuenciación de tercera generación (TGS): secuenciación de novo, basada en la tecnología de secuenciación de molécula única (SMS). El tipo de SMS NANOPORE SEQUENCING explora la electroforesis para conducir moléculas individuales (una a una) a través de nano-poros para su secuenciación.
• La secuenciación de nueva generación (NGS) es una tecnología de secuenciación masiva en paralelo que ofrece una gran velocidad y escalabilidad del proceso de secuenciación, junto con una secuenciación profunda de las regiones de ADN diana y una gran precisión de los resultados. La NGS requiere menos tiempo y es menos costosa que el método tradicional de secuenciación de Sanger. La NGS utiliza las tecnologías de secuenciación por síntesis (SBS, ILLUMINA) y secuenciación por ligadura (SBL, ROCHE 454). Una modificación de la SBL es la secuenciación por ligadura y detección de oligonucleótidos (SOLiD, ABI SOLID), cuya precisión de detección es aún mayor que la de los otros métodos de NGS. La tecnología de chip semiconductor se basa en la secuenciación por torrente iónico (ION TORRENT), cuya principal ventaja es su bajo coste.

Figura. 1.2. Tecnologías y plataformas de secuenciación del ADN (Zhang et al., 2021).

Procesamiento bioinformático de datos secuenciados, identificación de especies e interpretación de resultados

La tecnología NGS genera grandes cantidades de datos de secuenciación de ADN que exigen un procesamiento y un análisis asistidos por máquinas. En este caso, el enfoque in silico de la bioinformática ayuda a clasificar secuencias, recortar errores y agrupar organismos en varios niveles taxonómicos o, en caso de que no se conozca el taxón o la cobertura de la base de datos de ADN sea escasa, en unidades taxonómicas de operaciones moleculares (MOTU). El enfoque bioinformático ayuda a la anotación funcional de las secuencias obtenidas que predicen genes, operones y ARN funcionales. La predicción de secuencias de proteínas permite añadir miembros a grupos ya existentes, crear nuevos grupos ortólogos y asignar proteínas más precisas a grupos ortólogos distintos. Este enfoque determina si muestras independientes de ADNe procedentes de diversos entornos poseen perfiles funcionales similares basados en las proteínas que codifican.

Pasos del protocolo propensos a errores

• La especie objetivo determina el momento del muestreo. Depende de la historia o el comportamiento del individuo y debe elegirse cuidadosamente para no comprometer la representación cualitativa y la cuantificación del ADN diana dentro de la muestra de ADNe.
• Diseño del procedimiento.El diseño del ensayo debe tener en cuenta tanto las variaciones intraespecíficas como las interespecíficas. Si no se cubre todo el conjunto de variaciones genéticas de una especie diana, pueden obtenerse resultados falsos negativos. Por el contrario, si no se cubre toda la gama de variaciones genéticas en especies co-ocurrentes y genéticamente relacionadas, se puede registrar un resultado falso positivo. Por eso es esencial elegir una región genética que cubra la información genética disponible tanto para la especie objetivo como para las especies no objetivo relacionadas. Así, el ensayo tiene que ser lo suficientemente sensible y específico como para reducir al mínimo los resultados comprometedores.
• Control de la calidad del proceso.El ensayo tiene que incluir los controles positivos y negativos adecuados para la verificación interna de los resultados y su garantía de calidad. Estos controles deben abarcar todas las etapas del proceso:
• Extracción de ADN – un control negativo para detectar la contaminación cruzada entre extractos;
• Amplificación PCR – control positivo interno de cada pocillo para señalar la inhibición de la reacción; realización de la extracción de ADNe y qPCR en un laboratorio en el que no se manipulen otras muestras de ADN;
• Las muestras de ADN degradado y de baja calidad deben realizarse por triplicado para evitar falsos positivos;
• Deben desarrollarse curvas estándar para el ADN obtenido de diferentes muestras de una misma especie diana para ampliar el rango de resultados de las muestras;
• Controles del proceso: un control negativo que incluya especies fuera del rango de la especie diana y un control negativo que incluya muestras de agua destilada; uso de material fungible y cristalería estériles.
• Precisión de detección. Necesidad de muestras replicadas para evitar la incertidumbre y determinar los límites inferiores de detección, que no se conocen para cada especie y varían en función de diversos factores, como las dimensiones de la especie, la densidad, el comportamiento, el hábitat ambiental.

4.2. Retos e inconvenientes técnicos

4.2.1. Inconvenientes en la obtención y secuenciación de ADNe

Aunque esas aplicaciones del ADNe son indiscutibles, hay varias cuestiones que se consideran problemáticas y fuente de resultados malinterpretados o poco fiables. Los principales escollos, los problemas que plantean y los enfoques para su resolución se resumen en la Tabla 1.3.

Tabla 1.3. Los principales escollos técnicos del ADNe y sus enfoques de resolución.

Riesgos	Cuestión problemática	Enfoque de eliminación
Contaminación	– Posibles vías de contaminación: muestreo, todos los análisis de laboratorio – Contaminación cruzada: mezcla de ADN de distintas localidades – Propagación de copias de ADN por todo el laboratorio – Resultados falsos positivos	– Minimizar el número de secuencias obtenidas en una muestra – Realizar reacciones de PCR independientes para obtener un mismo éxito de amplificación – Separar físicamente los procesos previos y posteriores a la PCR – Incluir blancos para los pasos de muestreo, extracción de ADN y PCR
Inhibición de enzimas	– La co-extracción de ADN y sustancias húmicas provoca la inhibición de la Taq Polimerasa – Generación de perfiles falsos negativos	– Evitar la extracción de ácidos húmicos
Errores generados por la PCR y la secuenciación	– Mutaciones puntuales y formación de moléculas quiméricas – Falsos positivos durante la secuenciación	– Filtrar los datos brutos de secuenciación y practicar el «denoising» de las señales – Compaginar la eliminación de errores con la conservación de la mayor cantidad posible de información de secuenciación.
Coherencia temporal y especial de los resultados	– El tiempo de degradación del ADNe de diferentes hábitats varía de varios días a siglos, lo que da lugar a una baja consistencia temporal y especial de los resultados. – Transporte del ADNe dentro de los ecosistemas (principalmente acuáticos)	– Interpretación cuidadosa de los resultados a escala espacial y temporal
Aplicación del ADNe	– Enfoque monoespecífico – detecta sólo una especie a la vez – Enfoque multi-específico (metabarcodificación del ADN) – amplificación de determinadas secuencias (especies) con menos eficacia que otras (especies) – Fiabilidad de la cuantificación qPCR – definición de los verdaderos positivos a partir del fondo – Dificultades para traducir la diversidad de secuencias de ADN en diversidad de especies debido a la limitación del ADNe a secuencias cortas con baja resolución taxonómica.	– Optimización de cebadores genéricos para metabarcodificación – Utilización de un número normalizado de réplicas qPCR – Generación de patrones modelo para la producción y degradación del ADN – Relleno de las lagunas en las bases de datos de secuencias de ADN – Normalizar la agrupación de secuencias a partir de datos de metabarcodificación

4.2.2. Desafíos en la interpretación de datos

La interpretación de los resultados de los estudios de ADNe exige un enfoque crítico sólido. Los principales retos para la interpretación de los datos de ADNe están relacionados con los métodos de detección de ADNe que no diferencian entre organismos vivos y muertos, etapas vitales concretas (para los animales con ciclos vitales sofisticados) y especies híbridas (debido al uso de ADNmt que sólo detecta el linaje materno en una especie híbrida). Por otro lado, el ADNe detecta sólo una parte del número total de lugares ocupados por una especie determinada. En este sentido, se necesitan estimaciones fiables de la ocupación de las especies por los datos de ADNe.

Los retos técnicos de la interpretación de los datos de ADNe imponen otra cuestión relacionada con la elaboración de protocolos generales estándar para la autentificación de los resultados de los estudios de ADNe, especialmente los relacionados con la representación y conservación de la biodiversidad.

5. EL POTENCIAL DE APLICACIONES DEL ADNe

5.1. Mejora de los métodos de campo y los protocolos de laboratorio para la detección del ADNe

La mejora esencial de los métodos y protocolos de ADNe para combatir eficazmente los escollos e inconvenientes mencionados exige que la investigación futura del ADNe en ecosistemas terrestres y acuáticos para el seguimiento de la biodiversidad se centre en los siguientes temas principales.

• Estudio de la distribución espacial y temporal del ADNe en diversos hábitats para garantizar un seguimiento eficaz de la persistencia de las especies en el espacio y el tiempo;
• Establecimiento de vínculos mejor representados entre la cantidad de ADNe y la abundancia de especies para permitir conclusiones fiables sobre la densidad individual o la presencia total de biomasa;
• Determinación precisa de la fuente de ADNe para minimizar los errores en la interpretación de la abundancia de especies;
• Contabilización del impacto de los factores abióticos (T^oC, pH, salinidad, radiación UV) que influyen en la disponibilidad del ADNe y en las tasas de degradación;
• Aplicar mejoras técnicas, como la obtención de fragmentos de ADN más largos, la selección de genes nucleares y la explotación de la metabarcodificación de ADNe a gran escala y en ecosistemas más complejos.

5.2. Avances en la aplicación del ADNe como herramienta de inventario y seguimiento de la biodiversidad

La tecnología del ADNe ofrece importantes ventajas en comparación con los métodos tradicionales de seguimiento de la biodiversidad. Su avance metodológico comprende las siguientes características esenciales.

• Condiciones estandarizadas del protocolo de ADNe: desde el muestreo hasta la interpretación de los datos de secuenciación;
• Carácter no invasivo: la tecnología de ADNe es absolutamente inocua para las especies analizadas y sus hábitats ambientales;
• Independencia de la estación, la ubicación geográfica y las condiciones meteorológicas;
• Alta resolución de detección. La tecnología del ADNe se caracteriza por su gran sensibilidad. Se ha demostrado que sus métodos son mejores que los tradicionales cuando resulta difícil distinguir e identificar especies de homólogas estrechamente emparentadas.
• Relación coste-valor favorable. El ADNe ofrece un tiempo de manipulación más corto y costes más bajos que los enfoques tradicionales de seguimiento de la biodiversidad. El enfoque de metabarcodificación del ADNe se está volviendo progresivamente superior a los métodos tradicionales, con la disminución de los premios NGS;
• Emergencia de nuevas generaciones de tecnologías de secuenciación en tiempo real y métodos espectroscópicos.

 

6. REFERENCIAS

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