Модул 8 – Геномен подход за разработване на почвени биомаркери

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Почвата е универсален източник на жизненоважни за всички екосистеми на Земята свойства:

Най-голямото находище на хранителни вещества и вода за растенията;
Най-големият регулатор на газови емисии;
Основен участник в цикъла и рециклирането на биогенни елементи и молекули.

Негативните последици от климатичните промени, като интензивни наводнения или дълги периоди на засушаване, както и интензивните антропогенни дейности, свързани с промишлеността и селското стопанство, ускоряват фрагментацията на почвите. Необходими са спешни мерки за свеждане до минимум на тези отрицателни въздействия върху структурата на почвата и за опазване на нейното здраве.

Една от стратегиите, включваща потенциално въздействащ набор защитни мерки, е използването на биоиндикатори, които характеризират колебанията в състоянието на почвата и предоставят ценна информация, допълваща тази, натрупана от физико-химичното охарактеризиране.

В проучванията на околната среда се изследват различни биоиндикатори. Те обхващат различни царства и варират от микроорганизми до безгръбначни животни. Типични примери са:

Земни червеи (Moreiera et al., 2012);
Нематоди (Martin et al., 2022);
Бръмбари (Menta and Remelli, 2020);
Микроорганизми (Schloter et al., 2018 ).

Всички микроорганизми имат потенциал да бъдат полезни биоиндикатори благодарение на регламентираните методи, установени от Международната организация по стандартизация (ISO) за използването им при анализи на качеството на почвата (ISO 14240-1:1997, ISO 16072:2002, ISO/TS 10832:2009, ISO/TS 29843-1:2010, ISO 17601:2016, ISO 18400-206:2018, ISO 11063:2020). Въпреки това само един от тези методи (ISO 11063:2020) е свързан с геномни техники, приложими за директно извличане на ДНК от почвата.

Следователно съществува необходимост от знания и практически умения за използването на метагеномни техники за оценка на качеството и здравето на почвата чрез идентифициране на микробните почвени общности в отделни проби.

2. ОТКРИТИЯ

2.1. Микроорганизми – биомаркери за здравето на почвата

Биотрансформациите в почвата (например биогеохимичните цикли, натрупването и/или разграждането на органични вещества) се дължат на нейното биоразнообразие. Сред представителите на различните царства тези на Бактерии и Гъби са най-многобройни и с най-голям принос: над 80 % от гореспоменатите процеси са пряко свързани с микробния компонент на глобалната екосистема.

Почвеният микробиом – микробните съобщества в почвата и техният генетичен материал – е чувствителна система, която отразява колебанията в околната среда и бързо реагира на всички промени в нея, така че индивидите, които са по-добре адаптирани към тези промени, да могат да оцелеят и да се задържат в почвата.

Микробното биоразнообразие в почвата зависи от нейните физико-химични характеристики, степента на замърсяване и използваните техники за обработка на земята. По този начин,

pH: Fierer и Jackson, 2006 г;
Замърсяванетос тежки метали: Feng et al., 2018; и
Управлениетона земеползването: Bhowmik et al., 2019;

определят промените в микробните популации, които могат да се използват като индикатори за състоянието на почвата. Тъй като здравето на почвата се дефинира от Министерството на земеделието на САЩ като ….трайната способност на почвата да функционира като енергична жива екосистема за поддържане на растенията, животните, първичната продуктивност и екологичното биоразнообразие…., микроорганизмите в почвата могат да служат като ярък и надежден биоиндикатор.

В исторически план познанията за почвените микроорганизми датират от XIX век. Въпреки това има няколко важни етапа в научните изследвания, които подчертават техния потенциал като биоиндикатори за здравето на почвата:

Първият е установяването на ролята на почвените микроорганизми в кръговрата на хранителните вещества и използването им за количествено определяне на тяхната динамика. Експерименталната част изискваше култивиране и идентифициране на микробните видове и съответно – над 97% от бактериалните и архейните видове останаха неидентифицирани, тъй като не сакултивируеми. Така числеността на почвените микроорганизми остана слабо оценена и проучена.
Следващата стъпка е използването на мобилома на почвата. Това е така нареченият летлив генофонд, представен от плазмиди, бактериофаги и извънклетъчна ДНК, придобита чрез трансфер на гени (трансформация). Сред всички тях плазмидите са тези, които привличат вниманиетов най-голяма степен, тъй като носят гени, които придават ценни характеристики на техните гостоприемници (и на почвения микробиом като цяло) при стресови условия (например наличие на антибиотици или други химикали). Изследователите са доказали, че честотата и разнообразието на плазмидите се увеличават в отговор на променените условия на околната среда и появата на стресори. Тази зависимост позволява да се установят биомаркери на почвения мобилом, докладващи за появата на стрес в тези почви, и маркери за състоянието на почвата сама по себе си. Освен това подвижните генетични елементи, като Ti и Sym плазмидите, са отговорни за взаимодействията между микроби и растения и като такива са причина за хоризонталния трансфер на гени, който се осъществява с висока скорост в ризосферата на растенията. Същото важи и за взаимодействието между бактерии и гъби, например Burkholderia terrae и почвени гъби, при което определени бактериални генни клъстери могат да се използват като доказателство за взаимодействието на бактерии с гъби в почвата.
Последнатареволюция е молекулярната, която позволява използването на метагеномната техника за извличане на нуклеинови киселини директно от почвени проби и пропускане на етапа на култивиране за характеризиране на микроорганизмите.

Методологията на метагеномиката включва:

Извличане на ДНК/РНК директно от почвена проба;
Създаване на геномни библиотеки за всички микробни видове, открити в определен обект за изследване на почвата;
Секвениране и биоинформатична обработка.

Понастоящем техниката на метагеномиката се използва като биоиндикатор за анализ на състоянието на почвата.

Научете: Как ефективно да извлечем ДНК от почвата (видео)

Научете: Как се създават геномни библиотеки (видео)

Научете: Какво представлява геномното секвениране (видео)

2.2. Геномни/метагеномни изследвания на почвени микробни съобщества

Прилагането на метагеномни техники за изследване на здравето на почвата разкри голямото разнообразие от некултивируеми микроорганизми и доведе до разкодирането на нови геноми. Вече е възможно да се установи връзка между определени членове на микробните общности и определени почвени трансформации. Например:

Въздействие на антропогенната дейност – вариации в таксономичните групи микроорганизми;
Превръщане на природни земи в земеделски (напр. горски почви в пасища) – промени в почвения микробиом;
Въвеждане на бактериални таксони чрез селскостопански дейности – промени в почвения микробиом;
Използване на пестициди и торове – намалено изобилие на някои микробни видове.

Адаптацията и взаимодействието между почвените микробни съобщества, както и влиянието на промените в околната среда върху тези явления, могат да бъдат изследвани и чрез метагеномни подходи. За тези цели могат да се посочат два вида метагеномика.

Ръководената метагеномика (или метабаркодиране) търси таксономична идентификация в голям мащаб чрез ДНК анализ на един или малък брой гени. Този подход се прилага за изследване на относителното изобилие на определен ген, т.е.специфичен молекулярен маркер в почвена проба, и позволява идентифицирането на отделни таксономични групи. Молекулярните маркери са различни в зависимост от търсените организми. За микроорганизмите това са рРНК гените за 16S за бактериите и ITS елементите за гъбите.
„Shotgun“метагеномиката определя общото геномно съдържание на пробата чрез секвениране на библиотеки. Тази техника се прилага за определяне на функционалния потенциал на микробните общности. Освен това тя може да помогне за определяне на таксономичната идентичност, тъй като секвенира целия генетичен материал, наличен в почвената проба. По този начин „shotgun“ метагеномиката може да реконструира пълни гени и геноми, допринасяйки за тяхното анотиране и интерпретиране на метаболитните пътища.

В сравнителен контекст двете техники се различават по продукта, който дават, и по биоинформатичните методи, които използват. За биоинформатичните конвейери за метабаркодиране и „shotgun“ разгледайте Duque-Zapata et al., 2023.

Научете: Как се извършва метабоаркодиране (видео)

Научете: Принцип на метагеномното секвениране (видео)

3. АЛТЕРНАТИВИ (ОБСЪЖДАНЕ)

3.1. Ограничения и предизвикателства пред метагеномиката на почвата

Приносът на метагеномиката в разбирането ни за почвения микробиом е безспорен. Съществуват обаче някои ограничения и предизвикателства, които трябва да бъдат взети предвид.

Физични/химични характеристики на почвата. Физичните и химичните свойства на почвата оказват влияние върху състава и функционирането на почвения микробиом. При класическите метагеномни анализи се отчитат рН на почвата, температурата, влажността и органичният С. Влиянието на елементите K, P и Fe се пренебрегва или подценява.
Структура на почвата, дълбочина на вземане на проби и сезонни колебания. Гореспоменатите свойства варират в зависимост от дълбочината на почвата и сезонните промени в околната среда, което прави заключенията за конкретна почвена проба, трудно приемливи за идентифициране на микроорганизмите в екосистемен или глобален мащаб.
Технически затруднения. Метагеномиката на почвата генерира огромно количество необработени данни от секвениране. Този обем превръща възпроизвеждането на дадено научно изследване в истинско предизвикателство. Освен това за сравнително голям брой секвенции или таксономични единици липсва налична към момента информация. Метабаркодирането е ограничено до използването на PCR и до отклоненията, които могат да възникнат по време на биоинформатичната обработка. „Shotgun“метагеномиката зависи от дълбочината на секвениране, която трябва да бъде достатъчно голяма, за да покрие цялото геномно съдържание на всеки микроорганизъм, присъстващ в почвената проба, за да позволи интегрален анализ на функционалния му потенциал.

4. РЕШЕНИЯ

Метагеномните анализи допринасят за откриването на микроорганизми в различни области, което води до разработването на амбициозни проекти за изобретяването и прилагането на микробни биомаркери за оценка на почвеното здраве. Някои от тези области са представени по-долу.

4.1. Подход „One Health“ към здравето на почвата

“One Health” е обобщаващ термин, отнасящ се до взаимодействията между микроорганизмите, растенията, животните и хората, до това как те влияят върху хомеостазата на екосистемата, до ефектите, които оказват върху човешкото здраве, както и до откриването, превенцията и контрола на рисковете, които засягат човешкото здраве. Сред участниците в „One Health” микроорганизмите играят жизненоважна роля в екосистемите. Техните ефекти обхващат вредни за техните гостоприемници функции, ролята на фактори на вирулентност или резервоари на болестотворни гени/лекарствена резистентност. Тъй като по-голямата част от микроорганизмите не могат да се култивират, метагеномният подход за тяхното изследване разкрива перспективи за обогатяване на познанията ни за „One Health“ поради способността му да изследва как микроорганизмите си взаимодействат със заобикалящата ги среда. Полезни приложения в този смисъл могат да се намерят и в други области, свързани със здравето на глобалните екосистеми:

Проект „Човешки микробиом“ – епидемиологично наблюдение на човека и взаимодействието между микробиомите му: сравнително охарактеризиране на чревния микробиом на здрави и страдащи от различни заболявания хора.
Проект „Инфекция с Listeria” – разпознаване на повече от 33 нови малки РНК и 53 нови антисенс РНК с предполагаемо участие в инхибирането на експресията на различни регулаторни оперони в Listeria monocytogenes.
Проучване на пандемичния грип през 2009 г. – прилагане на подходи, базирани на метагеномиката (панвирусен микрочип и дълбоко секвениране), за изучаване на вариациите на грипния вирус H1N1 и откриване на възможността за сглобяване на генома му почти (90%) de novo. Тези техники се предлагат като превантивна стратегия и диагностичен инструмент за изследване на огнища на нови патогени.
Глобално наблюдение на антимикробната резистентност – прилагане на метагеномен подход за непрекъснато глобално наблюдение и прогнозиране на гени за антимикробна резистентност чрез използване на отпадъчни води – етично приемливо и икономически осъществимо решение.

Подходът „One Health“ бе задълбочен и разширен от концепцията за “Planetary Health”, която разглежда планетарните екосистеми и техните нарушения, свързани с климатичните промени, нарушенията на биогеохимичния цикъл на С и азот, загубата на биоразнообразие в световен мащаб и замърсяването на въздуха. Въпреки че изследванията по тази концепция са насочени към увреждането на почвата, връзката между здравето на почвата и здравето на планетата е силно призната. Сред тези, които заслужават внимание, са антимикробната резистентност и насърчаването на храненето с растителни продукти с цел намаляване на емисиите на парникови газове. Намаляването на употребата на пестициди и насърчаването на биоразнообразието на културите стимулират биоразнообразието на земеделските площи и почвения микробиом. Така глобалното биоразнообразие може да бъде обогатено и защитено. От друга страна, по-доброто управление на почвеното здраве и повишаването на обществената осведоменост за необходимостта от управление на почвения микробиом чрез добри земеделски практики може да помогне за намаляване почвените патогени и да забави разпространението на антимикробната резистентност.

Връзките между подходите и приоритетите на „One Health“ и „Planetary Health“, добрите селскостопански практики и тяхното отражение върху здравето на почвата са очертани в блок-схемата на фиг. 8.1.

4.2. Екогеномика

Екогеномиката (от екологична геномика) е клон на геномиката, който се стреми да разкрие ефекта от функционирането на гените/геномите върху взаимодействието на организмите в тяхната естествена среда. Използвайки метагеномиката като интегративен подход, изследователите изтъкват значението на взаимоотношенията между представителите на различни царства:

Растения– опрашители – приложение на метабаркодирането за оценка и изследване на взаимодействията между растенията и различни насекоми;
Микроорганизми – черна муха – приложение на метагеномиката за анализ на чревната микрофлора на черната муха и идентифициране на патогени, които могат да компрометират събирането на тези мухи за хранителни цели поради риск от зоонозни заболявания.
Растения– филосферни микроорганизми – метагеномно изследване на оризовата филосфера с акцент върху фитопатологичния потенциал на микроорганизмите, колонизиращи външната част на растенията.
Лечебни и ароматни растения– ризобактерии – метагеномен подход за идентифициране на бактериите, допринасящи за MAP свойствата с фармацевтично значение.
Технически култури– ризобактерии – метагеномни анализи на промоторни гени, регулиращи транскрипцията на гени, участващи във вегетативния растеж и С-цикъла в царевични полета с различна история на отглеждане и управление.
Животни– микроорганизми – растения – метабаркодиране на фекалиите на диви животни и определяне на видовете гъби и растения, за да се характеризира диетата им и да се разработят стратегии за опазване, чрез осигуряване на подходящи хранителни ресурси.

Фигура 8.1. Подходи на добрите земеделски практики в подкрепа на оздравяването на почвата и отражението им в подходите и приоритетите на „One Health“ и „Planetary Health“. (Източник: Montgomery et all., 2024)

4.3. Глобален запас на почвения микробиом

Прилагането на метагеномиката за изследване на почвения микробиом е не само амбициозна цел. Тя е от решаващо значение за създаването на стратегии за благосъстоянието, производството и опазването на растенията, животните и екосистемите. Биоразнообразието и метаболитната ефективност на почвения микробиом са обект на проекти, насочени към прилагането на метагеномни изследвания. Тези проекти имат за цел да разкрият изобилието и функциите на почвените микроорганизми чрез техники на геномиката.

Проект „TerraGenome“

Проектът „TerraGenome“ е международен изследователски консорциум, обединяващ 23 държави и работещ за установяване на пълен генетичен пръстов отпечатък на всички бактериални видове, присъстващи в референтни почвени проби от едно и също място – Ротамстед, Великобритания. Това място е избрано, тъй като използването и управлението му са добре регулирани в продължение на повече от 1,5 века. Проектът има две цели:

Създаване на каталог на всички гени в почвата и
Разкриване нафункциите и взаимодействието им.

Идеята на детайлното характеризиране на един почвен метагеном е той да се използва като референтен за бъдещи метагеномни анализи.

Изследователската площадка на проекта „TerraGenome“ стартира през 2008 г. с изолирането на ДНК, а година по-късно продължи с анализ на милиони ДНК последователности от почвата, в продължение на повече от 10 години.

Мащабът на проекта „TerraGenome“ е огромен; подобни са и техническите предизвикателства, тъй като хилядите геноми на отделните видове трябва да бъдат секвенирани, анотирани и сравнени. Проектът „TerraGenome“ не само убеждава в целите си, свързани със секвенирането на почвения микробиом, но и служи като стандартна платформа за други усилия за метагеномно секвениране на почвата.

Earth Microbiome Project (EMP)

EMP стартира през 2010 г. в САЩ като съвместна инициатива за изучаване на микроорганизмовата компонента в различни екосистеми и заобикалящата ги среда по целия свят при стандартни експериментални условия. Целта на този отворен, съвместен проект беше да се сравнят множество микробни общности чрез ампликонно секвениране и метагеномика.

Мисията на проекта EMP е да се създаде микробна карта на нашата планета, използвайки параметрите на околната среда в различните биоми, и да се изследват те чрез проби, събрани по целия свят.

Първите резултати от проекта EMP бяха публикувани през 2017 г. въз основа на близо 28 000 проби, събрани по целия свят (7 континента, 43 държави), обработка на над два милиарда последователности и идентифициране на 308 вида. Понастоящем е активна втората фаза на проекта EMP – проектът Earth Microbiome Project 500 (EMP500), насочен към метагеномно секвениране и метаболитно профилиране на микробни общности от различни места на Земята. EMP500 надгражда EMP с нови протоколи за метагеномно секвениране и сглобяване. Той разширява характера на експерименталните обекти, като включва различни местообитания и общо 500 проби, които отговарят на определени критерии, гарантиращи сравнимост и възпроизводимост на резултатите.

5. ПРЕПОРЪКИ (ЗАКЛЮЧЕНИЕ)

За оценка на здравето и качеството на почвата е необходим интегриран подход, който обединява използването на набор от променливи в обща рамка. Параметрите, които описват почвения микробиом, могат да бъдат групирани в такава мрежа и да се използват за разграничаване на състоянието на почвата при нормални и стресови условия.

Тази мрежа трябва да обединява както традиционни, така и иновативни показатели. Първите включват оценка на видимите качества на почвата и измерими физични и химични характеристики. Вторите включват усъвършенствани иновативни инструменти, резултат от научните познания и развитието на технологиите, довели до по-задълбочено разбиране на микробните процеси в почвата. Метагеномиката е един от най-влиятелните подходи и техники в тази връзка, тъй като позволява измерване на числеността и разнообразието на почвените микроорганизми. По този начин тя дава възможност почвеният микробиом да служи като надежден индикатор за оценка на състоянието на почвеното здраве.

Метагеномиката дава възможност за изучаване на структурата, биоразнообразието и функциите на микробните общности от различни среди – в нормални и стресови условия, и допринася не само за оценка на състоянието на почвата, но и за формиране на стратегии за биоремедиация, селскостопански практики и човешко здраве.

6. ЛИТЕРАТУРА

Duque-Zapata J.D., Lopez-Alvarez D., Muñoz J. E. Metagenomics approaches to understanding soil health in environmental research – a review. Soil Science Annual · April 2023 DOI: 10.37501/soilsa/163080

Ma B., Lu C., Wang Y. et al. (2023) A genomic catalogue of soil microbiomes boosts mining of biodiversity and genetic resources. Nat Commun 14, 7318. https://doi.org/10.1038/s41467-023-43000-z.

Montgomery R. R., Rabinowitz P., Sipos Y., Wheat E. E. (2024) Soil health: A common focus for one health and planetary health interventions. One Health, 18, 100673 https://doi.org/10.1016/j.onehlt.2023.100673

Vogel, T., Simonet, P., Jansson, J. et al. TerraGenome: a consortium for the sequencing of a soil metagenome. Nat Rev Microbiol 7, 252 (2009). https://doi.org/10.1038/nrmicro2119

Xu Z, Hansen MA, Hansen LH, Jacquiod S, Sørensen SJ (2014) Bioinformatic Approaches Reveal Metagenomic Characterization of Soil Microbial Community. PLoS ONE 9(4): e93445. doi:10.1371/journal.pone.0093445