Модул 4 – Метаболомика: изследване на реакциите на микроорганизмите към стресовите фактори на околната среда

1. ВЪВЕДЕНИЕ

1.1. Метаболомиката и нейният принос за идентифициране и количествено определяне на метаболитите в клетката и за откриване на механизмите на основни клетъчни процеси

Метаболомиката е една от най-новите „омични“ науки, заедно с протеомиката, геномиката и транскриптомиката. Тези три науки са тясно свързани с изучаването на ДНК в клетката (геномика), РНК и разликите в експресията на иРНК (транскриптомика), допълнени от метаболомика с изследване на целия набор от съединения с ниско молекулно тегло в клетката в даден момент (метаболом).

Метаболомиката е нов клон на биологията, медицината и науките за околната среда, който се фокусира върху изучаване на метаболитите – малки молекули в клетките, тъканите и биологичните течности на организмите, произведени от метаболитни процеси в тялото (фиг. 4.1). Тя се фокусира върху анализиране на метаболитния профил на даден организъм, за да разбере промените в метаболитната активност на клетките, тъканите или целия организъм при различни физиологични състояния или заболяванията.

Фигура 4.1 . Пример на метаболитен модел за Escherichia coli

Метаболитите (малки молекули) са аминокиселини, въглехидрати, липиди, нуклеотиди и други крайни или междинни продукти на метаболизма, които играят ключова роля в клетъчните процеси. Те са крайните продукти на процесите, протичащи в клетката, и следователно метаболомът включва всички метаболити в биологичната клетка, тъкан или организъм. Метаболитите изпълняват различни функции, като осигуряване на енергия (глюкоза), поддържане на клетъчната структура, каталитична активност, стимулиращи и инхибиращи ефекти върху ензимите и защита на организма.

Метаболомиката е много важна, като се има предвид ролята на метаболитите в живота и функциите на клетките. Тя предоставя информация за профила на пробата и съединенията в нея в определено време при специфични условия на околната среда. Това е важна информация за физиологичното състояние на организма. Метаболомиката може да определи разликите между нивата на хиляди молекули между здрав и болен организъм, между традиционни и генетично модифицирани култури и т.н.

Метаболомиката изучава пълния биохимичен фенотип (или метаботип) на всеки биофлуид, клетка, тъкан или организъм, както качествено, така и количествено. Генетичните фактори и факторите на околната среда могат да повлияят на състоянието на малки молекули, химични процеси и техните взаимодействия в биологична клетка, тъкан или организъм (метаболом). Метаболомиката има за цел да открие метаболити чрез определяне на всички метаболити в биологични проби (напр. кръв, урина, тъкан), оценка на техните концентрации при различни състояния или заболявания и картографиране на метаболитните пътища, за да разбере как се променят биохимичните реакции в клетките.

Най-широко използваните методи в метаболомиката включват различни аналитични техники за измерване на метаболитните нива (Таблица 4.1.). Приложението на метаболомиката обхваща различни области (Таблица 4.2.).

Таблица 4.1. Използване на аналитични техники за измерване на нивата на метаболитите.

Метод	Приложение
Маса спектрометрия (MS)	Позволява точно определяне на масата на молекулите и техния състав.
Ядрено магнитен резонанс (ЯМР)	Идентифицира и количествено определя метаболитите
Газ хроматография (GC)	Разделя летливите и полулетливите метаболити

Таблица 4.2. Области на приложение на метаболомиката.

Област	Приложение
Лекарство	За установяване причинно-следствие на отношенията между човешкото здраве, метаболомните пътища, и заболявания; За поддържане на прецизността на лекарството и индивидуализиран подход за лечение; Да се развиват биомаркери за диагностика и прогнозиране на различни заболявания, придобиване на по-дълбоко разбиране на биохимията на тялото и отговори към външни стимули.
Фармацевтична индустрия	до определя ефектите на лекарствата върху метаболизма; до открива нови биоактивни съединения с потенциал за фармацевтични приложения.
Селско стопанство	За оценка на растенията, животните, и почвата за здравето и за развиване на нови методи за увеличаване на добиви; За оценка на метаболитните реакции на растенията към различни стресови фактори и за развиване на устойчивост към болести, вредители или екстремни климатични условия на сортове култури; Да се оптимизират селскостопанските практики чрез анализ на метаболитите в растения и по-ефективно използване на ресурсите.
Хранителна промишленост	Да се подобри здравето и храните чрез оценка на тяхното качество и безопасност.
Екотоксикология	За оценка на въздействието на химикали върху околната среда, върху метаболизма на организмите, риска от замърсители и развиване на стратегии за опазване на екосистемите.

1.2. Потенциал на метаболомиката на околната среда

Метаболомиката на околната среда е насочена към решаване на важни проблеми, свързани с екосистемата, и разкрива голям потенциал за:

• Идентифициране на метаболитни профили, които организмите произвеждат в отговор на различни фактори на околната среда;
• Мониторинг на замърсяването след идентифициране и количествено определяне на токсични вещества в околната среда. Анализът на метаболитите в организмите показва наличието на замърсители като тежки метали, пестициди и други химикали.
• Разработване на нови технологии за пречистване на водата и почвата от замърсители, тъй като някои бактерии могат да разграждат токсични вещества чрез своите метаболитни процеси.
• Оценка на екологичния стрес и влиянието на различни фактори като климат, почвени условия, замърсяване и други екологични стресови фактори върху метаболизма на растенията, животните и микроорганизмите в естествени условия.
• Идентифициране на биомаркери на стреса, за отчитане нареакцията на организмите към промените в околната среда, като физиологични адаптации или токсикологични ефекти. Идентифициране на специфични метаболити, които служат като индикатори за здравето на екосистемата.
• Идентифициране на механизми за адаптация – адаптиране на метаболизма на организмите за оцеляване в различни среди, прогнозиране на тяхната устойчивост към бъдещи промени в климата или други екологични предизвикателства.
• Мониторинг на здравето на екосистемите чрез анализиране на метаболитните профили на различни видове, оценка на цялостното здраве на екосистемите и идентифициране на екологични проблеми или заплахи, като замърсяване или изменение на климата.

Метаболомиката на околната среда все още е сравнително нова област в България, както и в много други страни, но има голям потенциал за развитие и приложение в различни научни и практически направления.

1.3. Предизвикателства на метаболомиката на околната среда при представянето и интерпретацията на данни

Метаболомиката на околната среда е мощен подход за изучаване на химическите взаимодействия между организмите и тяхната среда и генерира големи и разнообразни набори от данни. Тълкуването на данни често е трудно поради няколко причини:

• Сложност и хетерогенност на пробите – метаболомните анализи често идентифицират хиляди метаболити и сложни неизвестни съединения, които са слабо проучени. Проби от околната среда като почва, вода или седименти са хетерогенни проби от сложни смеси от органични и неорганични съединения, което прави анализа труден. Освен това някои метаболити са представени в ниски концентрации, което прави откриването и количественото им определяне предизвикателство.
• Стандартизация и възпроизводимост – прилагането на различни методологии за извличане, анализ и обработка на данни може да доведе до несравними резултати поради липса на стандартизирани протоколи. Освен това прилагането на разнообразно оборудване и аналитични методи оказва влияние върху точността и надеждността на трудни за възпроизвеждане данни. Оборудването е с различна чувствителност и обхват. Фоновите сигнали от други вещества в пробите затрудняват идентифицирането на конкретни метаболити.
• Интерпретация на данните – наличието на изомери със сходни химични свойства и липсата на съответствия в наличните бази данни усложнява диференцирането им.
• Интегриране с други „omics“ данни – определянето на връзката между метаболитите и факторите на околната среда не винаги води до разбиране на причинно-следствените връзки. Следователно, метаболомиката е интегрирана с други „omics“ данни, като комбиниране с геномика, протеомика или транскриптомика. Интегрирането на тези различни нива на данни изисква сложни биоинформатични подходи и правилна интерпретация.
• Представяне на резултатите – трудността при представянето на големи обеми от данни по разбираем и достъпен начин и ефективната визуализация на многоизмерни данни често изисква специализиран софтуер и умения.

Потенциалните решения на тези предизвикателства включват използването на по-чувствителни и високопроизводителни аналитични технологии, бази данни и стандартизирани протоколи, многовариантни статистически методи и машинно обучение за по-добър анализ и интерпретация. Развитието на екологичната метаболомика зависи от преодоляването на тези предизвикателства, позволявайки по-добро разбиране на взаимодействията на екосистемите и тяхното устойчиво управление.

2. МЕТАБОЛОМНО РАЗНООБРАЗИЕ НА ЕКОСИСТЕМИТЕ

Екологията е наука, дял от биологията, който изучава взаимодействията между организмите, както и средата, в която живеят. Основният предмет на изучаване на екологията са екосистеми, взаимосвързани мрежи от растения, животни и други организми в даден географски район, зависещи един от друг. Екометаболомиката анализира метаболома, общия брой метаболити и неговите промени в отговор на промените в околната среда.

Докато видовете и генетичното разнообразие са добре известни понятия, метаболомното разнообразие остава сравнително неизследвано. То представлява разнообразието от малки молекули (метаболити) в живите организми. Източници на метаболомно разнообразие са главно микроорганизми в почвата, водата и растенията, както и растения и животни, които произвеждат вторични метаболити за защита, комуникация и адаптиране към околната среда. Много фактори влияят върху метаболитните профили, като климат, тип почва, наличие на вода, хранителни вещества и др.

Метаболомното разнообразие е резултат от сложните взаимодействия между различните организми в една екосистема, техните метаболитни пътища и физикохимичните условия на околната среда. Човешката дейност, изменението на климата и други фактори оказват значително влияние върху метаболомното разнообразие на екосистемите. Например замърсяването с тежки метали може да доведе до промени в метаболизма на растенията и животните, а изменението на климата може да повлияе на разпространението на определени метаболити в екосистемата.

Метаболомното разнообразие е от основно значение за функциониране на екосистеми и способността им да се адаптират към промените. Изучаването му помага да се разберат по-добре взаимодействията между видовете и връзката между биотичните и абиотичните фактори в околната среда, да се предостави ценна информация за здравето на нашата планета и да се разработят по-ефективни стратегии за опазване на околната среда (Фиг. 4.2).

Фигура 4.2. Въздействия върху метаболомното разнообразие на екосистемите.

3. МЕТАБОЛОМИКА И МИКРОБИОЛОГИЯ НА ОКОЛНАТА СРЕДА

3.1. Метаболомни изследвания на естествени микробни общности

Микроорганизмите са най-разпространените форми на живот в почти всяко местообитание на Земята. Въпреки размера си, те могат да причинят сериозни заболявания, да почистят замърсените почви и води и да променят глобалния климат. Разнообразието от микроорганизми е впечатляващо, както и метаболитното им разнообразие, но много от тях остават неизследвани. Някои микроорганизми виреят при екстремни условия. Екологичните транскриптомични и протеомни изследвания разкриха метаболити, активни в екстремофилни общности. Метаболитите, пряко свързани с тяхната физиология, са по-малко дефинирани, тъй като метаболомните методи изостават от другите omics технологии поради широк спектър от експериментални сложности, често свързани с матрицата на околната среда.

Протеомиката и транскриптомиката на общността могат да дадат представа за потенциалната функция на съвместно съществуващи микроорганизми in situ. Тези анализи обаче не са възможни за метаболити с малка молекула, които са основни за физиологичното или фенотипно състояние на организма. Естествените микробни общности са сложни екосистеми, съставени от милиарди микроорганизми, взаимодействащи помежду си и с околната среда. Тези общности играят ключова роля в много природни процеси, като разлагане на органичната материя, кръговрата на хранителните вещества и биогеохимичните цикли. Използват се различни методи за разбиране на функционирането на тези общности, включително метаболомни изследвания.

Напредъкът в аналитичните техники позволява изследването на това разнообразие чрез едновременно измерване на хиляди известни и неизвестни микробни метаболити, като по този начин се заражда микробната метаболомика.

3.2. Метаметаболомика – анализ на колективния метаболом на микробни общности

Микробната метаболомика има за цел да изучи всички аспекти на микробния метаболизъм чрез измерване на метаболитите вътре и извън микробите, независимо дали живеят в монокултури, в лаборатория или в сложни екологични общности. Прилагането на метаболомични изследвания към естествени микробни общности ни позволява да получим информация за биохимичните процеси и метаболитните пътища, активни в общността, взаимодействията между микроорганизмите в различни микробни видове и промените в метаболизма на общността в отговор на промените в околната среда.

Метаболомните изследвания на естествените микробни общности представляват бързо развиваща се област на науката, която ни предоставя нови възможности да разберем сложността и разнообразието на микробния свят чрез:

• Откриване на ключови вътреклетъчни и извънклетъчни метаболити, участващи в клетъчните процеси, като йонна хомеостаза, редокс статус, цикъл на хранителните вещества, енергетика и клетъчно-клетъчно сигнализиране.
• Разбиране на функциите на екосистемата и как микробните общности допринасят за функционирането на екосистемата.
• Откриване на нови биоактивни съединения, коитоса богат източник на нови вещества с потенциални приложения в медицината, фармацията и биотехнологиите.
• Мониторингът на околната среда чрез метаболомнитепрофили на микробните общности може да се използва като биомаркери за оценка на качеството на околната среда.
• Метаболомните изследвания на микробните общности се използват при:
• Проучване на почвените микробиоми чрез характеризиране на метаболитния профил на почвените микробиоми и оценка на тяхното въздействие върху почвеното плодородие и растежа на растенията.
• Анализ на чревната микробиота за човешкото здраве, връзката между състава на чревната микробиота и различни заболявания, като затлъстяване, диабет и възпалителни заболявания на червата.
• Мониторинг на водните екосистеми, за да се оцени въздействието на тяхното замърсяване и да се открият нови биомаркери за мониторинг на качеството на водата.

3.3. Естествени микробни съобщества – повърхностни води (специфични екологични ниши), подпочвени води, почва и др.

В зависимост от околната среда микробните общности се адаптират към различни екологични ниши. Разнообразието от екологични ниши е голямо поради разликите в светлината, температурата и наличието на хранителни вещества в екосистемата. Тя се регулира естествено от потоци, температурни колебания и ултравиолетова радиация. Микробните общности са критични за поддържането на живота и са тясно свързани с химичните и физичните свойства на обитаемата среда. Проучването на техните екологични ниши помага да се разберат глобалните екосистемни процеси. Съществува голямо разнообразие от микробни общности в естествената среда, както е показано в таблица 4.3.

Таблица 4.3. Разнообразие на микробен общности в естествени среди.

Микробна общност	Видове микроорганизми
Повърхностни води (реки, езера, морета и океани)	Планктонни микроорганизми – бактерии, археи, фитопланктон и зоопланктон, плуват свободно във водния стълб. Те играят роля в цикъла на въглерода и кислорода. Париеталните микроорганизми обитават повърхностите на растенията и скалите, образувайки биофилми. Ключовите групи са цианобактериите, които фотосинтезират, и хетеротрофните бактерии, които разграждат органичната материя.
Подпочвени води : адаптирани към бедна на хранителни вещества среда и ограничен достъп до кислород и светлина	Хемоавтотрофи, използващи неорганични съединения за енергия; Анаеробни бактерии, метаногенни археи, сулфат-редуциращи бактерии и денитрифициращи бактерии; Ендолитни микроорганизми, разположени в порите на скалите, оцеляват при минимална светлина.
Почва: най-разнообразни общности със значителна роля в рециклиране на органични вещества, разграждане на токсините и абсорбция на остатъците	Ризобактерии, живеещи в близост до корените на растенията, където осъществяват симбиоза; Деградатори, които разграждат органичните вещества и участват в образуването на хумус; Патогенни микроорганизми, които причиняват болести по растенията или почвата.
Други среди	Вулканични горещи извори, солени езера и ледници, обитавани от екстремофили (термофили и халофили); Въздушна среда: микроби, съществуващи като аерозоли в атмосферата, разпространявани от ветровете; Морски седименти: анаероби, които метаболизират органични съединения при ниско кислородно налягане.

3.4. Разкриване на функционалната значимост на микробиомното разнообразие – характеризиране чрез специализирани статистически инструменти

Разкриването на функционалното значение на разнообразието от микробиоми и свързаното с него метаболомно разнообразие изисква интегрирани статистически подходи и специализирани инструменти за анализ. Чрез използването на тези методи и инструменти е възможно да се направи функционална интерпретация, както и да се обобщи метаболомното разнообразие. Комбинирането на мултиомични данни позволява по-задълбочено разбиране на взаимодействията между микроорганизмите и тяхната среда. Основните стъпки и подходи за характеризиране и обобщаване на тези данни са:

• Събиране на данни и предварителна обработка – за микробиомни и метаболомни данни.
• Оценка на разнообразието на микробиомите – Алфа-разнообразие (разнообразие в проба), Бета-разнообразие (разлики между пробите).
• Характеризиране на метаболомното разнообразие чрез идентифициране на специфични метаболоми и класификация на метаболитите, статистически анализи спрямо функционални групи и др.
• Интегриране на микробиомни и метаболомни данни с помощта на каноничен корелационен анализ (CCA), анализ на Прокруст или методи за свързване на различни типове данни и машинно обучение.
• Обобщаване на данни и визуализация с топлинни карти за връзките между микроби и метаболити и мрежов анализ за функционални взаимодействия.
• Инструменти и софтуер – QIIME 2 за микробиомни анализи. MetaboAnalyst за метаболомни анализи (R пакети като phyloseq, vegan, mixOmics за статистически анализи) и Python пакети, като scikit-learn, seaborn и matplotlib за моделиране и визуализация.

4. МОДЕЛИРАНЕ НА ЛАБОРАТОРНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ НА МЕТАБОЛИТИ В ОКОЛНАТА СРЕДА

Моделирането на лабораторни изследвания на метаболити в околната среда е мощен инструмент за разбиране на сложните биохимични процеси, протичащи в естествените екосистеми. Чрез комбиниране на експериментални данни и математически модели можем да получим по-пълна картина на метаболитните мрежи и да разработим нови стратегии за опазване на околната среда. Използвайки математически модели и компютърни симулации, ние можем да симулираме експериментални условия, да анализираме големи количества данни и да изграждаме хипотези за механизмите, лежащи в основата на наблюдаваните явления. Моделирането на лабораторни изследвания предоставя няколко предимства, като например:

• По-добро разбиране на сложни екосистеми, в които моделирането ни позволява да симулираме взаимодействия по нелинейни начини между множество фактори, коитовлияят върху метаболитните процеси.
• Оптимизиране на експерименти чрез планиране и оптимизиране на експерименти чрез идентифициране на най-подходящите условия за наблюдение на определени процеси.
• Прогноза за бъдещи събития чрез предвиждане как промените в околната среда ще повлияят на метаболитни процеси и оценка на потенциалните последици от тези промени.

Анализът на големи данни чрез моделиране позволява анализиране огромни количества генерирани метаболомни данни и ефективно извличане на полезна информация. Различни модели, разработени за симулиране на лабораторни изследвания на метаболити от околната среда, са представени на Фиг.4.3.

Фигура 4.3. Различни модели симулиращи лабораторни проучвания на метаболити от околната среда

4.1. Категории метаболомни изследвания на околната среда

„Метаболомът“ на даден организъм е неговият пълен набор от метаболити, пълният биохимичен фенотип (или метаботип) на всеки биофлуид, клетка, тъкан или организъм, както качествено, така и количествено.

Чрез анализиране на метаболомите можем да получим ценна информация за биохимичните процеси, протичащи в околната среда, и да разработим нови стратегии за опазване на природата. Основните категории на екологичната метаболомика са показани в Таблица 4.4.

Таблица 4.4. Видове екологична метабоомика.

Метаболомен тип	Характеристики
Метаболомика на почвите	Изучава биохимичните процеси в почвата, свързани с разграждане на органичната материя, кръговрата на хранителните вещества и взаимодействието между растенията, микроорганизмите и почвата. Той предоставя важна информация за оценка на почвеното плодородие, мониторинг на замърсяването на почвата и разработване на стратегии за биоремедиация.
Метаболомика на водна екосистема	Анализира метаболитните профили на водните организми и водната среда, за да оцени качеството на водата, да идентифицира замърсителите и да наблюдава въздействието на изменението на климата.
Метаболомика на въздуха	Идентифицира летливи органични съединения (ЛОС) в атмосферата, произхождащи от естествени и антропогенни източници, и оценява тяхното въздействие върху здравето и околната среда.
Метаболомика на екстремна среда	Изследва адаптацията на организмите към екстремни условия (висока температура, соленост, радиация и др.) и откриването на нови биоактивни съединения.
Метаболомика на взаимодействието между организмите	Проследява метаболитните взаимодействия между различни организми (растения, животни, микроорганизми) и тяхната среда.

5. МЕТАБОЛОМИКА ОЦЕНКА НА УСТОЙЧИВОСТТА НА СТРЕСА НА ОКОЛНАТА СРЕДА

5.1. Метаболомика на околната среда при изучаване на реакциите на тялото към стресовите фактори на околната среда

Метаболомиката на околната среда е мощен инструмент за изучаване на реакциите на организмите към стресови фактори. Чрез анализиране на метаболомни профили можем да получим ценна информация за механизмите на стреса, да идентифицираме биомаркери за ранна диагностика на заболявания, да разработим нови стратегии за опазване на околната среда и човешкото здраве. Метаболомиката на околната среда се използва широко за:

• Разкриване на механизмите на стреса чрез анализ на метаболомните профили и идентифициране на специфичните метаболитни пътища, засегнати от стреса. Това позволява по-добро разбиране на механизмите, които са в основата на реакцията на стрес.
• Оценка на ефектите от интервенциите, насочени към намаляване на стреса. Възможно е да се сравнят метаболомните профили на организми, подложени на определен стрес преди и след прилагане на терапията. Метаболитните профили на организмите могат да служат като чувствителни биомаркери за оценка на стреса. Промените в нивата на метаболитите могат да сигнализират за дисбаланс в метаболизма в резултат на излагане на стрес. Оценяването на ефектите от стреса върху човешкото здраве е съществена част от идентифицирането на биомаркери за ранна диагностика на заболявания, свързани със стреса. Това е основата за разработване на нови терапевтични средства, като откриване на нови лекарствени цели и разработване на персонализирани терапии.
• Оценка на въздействието на замърсителите чрез идентифициране на биомаркери за замърсяване с тежки метали, пестициди и други токсични вещества.
• Изучаване на изменението на климата и реакциите на растенията и животните към промените в температурата, влажността и други климатични фактори.

Въпреки големия си потенциал метаболомиката на околната среда все още има някои предизвикателства. Въпреки това бъдещето на метаболомиката на околната среда изглежда обещаващо. С развитието на нови технологии и алгоритми тази област ще продължи да играе все по-важна роля в разбирането на взаимодействията между организмите и тяхната среда.

5.2. Метаболомни анализи на микробни първични и вторични отговори на оксидативен стрес

Оксидативният стрес е състояние, при което има дисбаланс между генерирането на реактивни кислородни видове (ROS) и способността на клетката да ги неутрализира. Той е един от основните фактори, допринасящи за увреждането на клетките и развитието на различни заболявания. Микроорганизмите, подобно на по-големите организми, са изложени на оксидативен стрес и са развили механизми за справяне с него. Метаболомните анализи предлагат мощни инструменти за изследване на тези механизми на молекулярно ниво, включително първични и вторични реакции на оксидативен стрес.

Първичните реакции на оксидативен стрес включват увреждане на биомолекули като ДНК, протеини и липиди от ROS. Метаболомните анализи могат да идентифицират продуктите от това увреждане, като окислени липиди, карбонилни групи в протеини и окислени бази в ДНК. Следващият етап на оксидативния стрес са вторичните реакции, които са свързани с различни сигнални пътища и регулаторни механизми, активирането, което се опитва да възстанови хомеостазата. Метаболомните анализи могат да идентифицират промени в метаболитните профили, които отразяват тези отговори в детайли.

Метаболомните анализи предоставят мощни инструменти за изучаване на микробните отговори на оксидативния стрес. Чрез идентифициране на промените в метаболитните профили можем да придобием по-задълбочено разбиране на механизмите, които са в основата на тези реакции. Тази информация може да се използва за разработване на нови стратегии за борба с инфекциозните заболявания и подобряване на човешкото здраве.

• Метаболомните анализи включват идентифициране на биомаркери, които са специфични метаболити, които могат да служат като биомаркери за оксидативен стрес. Чрез анализиране на промените в метаболитните профили могат да бъдат идентифицирани метаболитните пътища, които са най-засегнати от оксидативния стрес. Тези анализи могат да се използват за оценка на ефективността на различни антиоксиданти и други интервенции за намаляване на оксидативния стрес. Прилагането на метаболомни анализи при изследване на оксидативния стрес в микроорганизмите има за цел:
• Изследване на устойчивостта на патогенни микроорганизми към антибиотици, при което оксидативният стрес може да допринесе за развитието на антибиотична резистентност.
• Изучаване на адаптацията на микроорганизмиte, обитаващи екстремни среди към тези условия. Микроорганизмите, изложени на висок оксидативен стрес, развиват уникални механизми за справяне с него.
• Разработване на нови антимикробни агенти въз основа на идентифициране на нови цели за антимикробни агенти и метаболитни пътища, включени в отговора на оксидативния стрес.

5.3. Метаболитен стрес в бактериите, причинен от замърсяване с метали

Замърсяването на околната среда с тежки метали е сериозна заплаха за всички живи организми, включително бактериите. Тези микроорганизми са адаптивни и могат да колонизират различни среди, дори такива с високи концентрации на токсични вещества. Излагането на метали обаче води до значителни промени в метаболизма на бактериите, наричани метаболитен стрес. Метаболомният стрес, причинен от замърсяването с метали, е от голям интерес за учените, като метаболомните анализи предоставят мощни инструменти за изследване на механизмите на действие на тежките метали върху бактериите и за разработване на стратегии за справяне с този проблем. Основата на метаболомния стрес е да се установят механизмите на действие на тежки метали като олово, кадмий, живак и арсен, които могат да повлияят на бактериалните клетки по различни начини:

При оксидативен стрес металите могат да генерират реактивни кислородни видове (ROS) и да увредят ДНК, протеини и липиди. Увреждането на ДНК води до мутации и генетична нестабилност. Тежките метали могат да се свържат с фосфолипидите в клетъчната мембрана, нарушавайки нейната пропускливост и стабилност. Металите също могат да се свързват с ензимите и да инхибират тяхната активност, нарушавайки основните метаболитни процеси.

Много често се наблюдават метаболомни промени при бактерии, изложени на тежки метали. Метаболомният анализ позволява специфични промени в метаболитния профил на идентифициране на бактерии в отговор на излагане на метал. Тези промени могат да включват натрупване на метаболити в бактерии като механизъм за детоксикация или като отговор на клетъчно увреждане или изчерпване на метаболитите в резултат на повишена консумация или инхибиране на синтеза. Металите могат да нарушат регулирането на различни метаболитни пътища, което води до промени в производството на енергия, синтеза на биомолекулите и други процеси. Приложенията на метаболомния анализ са от голямо значение за:

• Оценка на металната токсичност чрез сравняване на метаболомните профили на бактерии, изложени на различни концентрации на метали и определяне на тяхната токсичност.
• Идентификация на биомаркери чрез метаболомни анализи на специфични метаболити, които могат да служат като биомаркери за излагане на метал.
• Разработване на стратегии за биоремедиация в резултат на метаболомни анализи, които могат да помогнат за разработването на нови стратегии за биоремедиация на почви и води, замърсени с тежки метали.

6. МЕТОДИЧЕСКИ И ТЕХНИЧЕСКИ РАЗРАБОТКИ

6.1. Постиженията на метаболомиката в областта на водната екотоксикология

Във водната екотоксикология метаболомиката се оказа особено ценен инструмент за оценка на въздействието на замърсителите върху водните организми. Той предоставя „моментна снимка“ на метаболитния профил на организма, която предоставя не само генетична информация, но също така отразява влиянието на околната среда и всички биохимични процеси, протичащи в организма. Това го прави изключително чувствителен инструмент за откриване на ранни промени, предизвикани от излагане на токсични вещества. Метаболомиката позволява идентифицирането на ранни биомаркери за токсичност, разкриване на механизмите на действие на замърсителите и разработване на по-ефективни стратегии за опазване на водните ресурси. Също така предоставя нови методи за оценка на въздействието на замърсителите върху водните организми и екосистеми. Няколко ключови постижения и приложения на метаболомиката в тази област са свързани с откриването на специфични метаболити, които се променят в отговор на излагане на токсични вещества във водата. Тези метаболити могат да служат като биомаркери за токсичност и да помогнат за ранното откриване на вредните ефекти. Освен това чрез анализиране на метаболитни профили е възможно да се разбере как определени замърсители влияят върху метаболизма на водните организми. Той помага да се разкрият механизмите на токсичност и да се разработят стратегии за защита на водните екосистеми.

Въздействието върху оценката на водните организми е важна част от изследването.

Метаболомиката позволява създаването на модели, които предвиждат въздействието на замърсителите върху водните организми. Тези модели могат да се използват за оценка на риска за разработване на регулаторни стандарти и моделиране на екотоксикологичните ефекти.

Относителната токсичност на химикалите може да бъде оценена и усилията за контрол на замърсяването могат да бъдат приоритизирани чрез изучаване на различни видове замърсители и сравняване на метаболитните профили на организми, изложени на замърсители.

Приложението на метаболомиката в областта на водната екотоксикология е свързано с мониторинг на качеството на водата, който е:

• Реален мониторинг на водни тела, използван за наблюдение на качеството на водата в реално време. Чрез анализиране на метаболитните профили на водните организми се откриват промени, които показват наличието на замърсители и какви коригиращи действия трябва да се предприемат.
• Дългосрочният мониторинг на метаболитните профили може да предостави информация за хроничните ефекти на замърсителите върху водните екосистеми и да помогне за разработването на дългосрочни стратегии за управление на водните ресурси.

Разработват се нови технологии и методи, които се интегрират с други „omics“ технологии. Метаболомиката често се комбинира с геномика, протеомика и транскриптомика, за да се получи по-пълна картина на биологичните реакции към замърсителите. Тази интеграция позволява по-точно разбиране на сложните взаимодействия между генетиката, протеините и метаболитите. Разработват се и нови аналитични техники и инструменти, които подобряват точността и чувствителността на измерванията. Това включва усъвършенствани методи за спектроскопия, хроматография и статистически анализ.

Метаболомиката е мощен инструмент в областта на водната екотоксикология, който позволява подробно изследване на въздействието на замърсителите върху водните организми и екосистеми. Чрез идентифициране на биомаркери, разбиране на механизмите на токсичност и разработване на нови технологии метаболомиката допринася значително за опазването на водните ресурси и здравето на водните екосистеми.

6.2. Нови статистически предизвикателства – биоинформатика

Биоинформатиката и метаболомиката са две бързо развиващи се области на науката, които, комбинирани, предлагат мощни инструменти за разбиране на сложни биологични системи. Комбинирането на биоинформатиката и метаболомиката създава синергичен ефект, който позволява:

• Идентифициране нанови биомаркери чрез интегриране на геномни, транскриптомни и метаболомни данни, които могат да се използват за откриване на нови биомаркери за диагностика и мониторинг на различни заболявания.
• Разкриване намеханизмите на заболяването чрез анализиране на метаболомни промени, свързани с болести, и идентифициране на ключови метаболитни пътища, които са нарушени.
• Разработване нанови терапевтични средства, като се разберат метаболитните промени, предизвикани от заболявания, и разработване на нови лекарствени молекули, които възстановяват нормалната метаболитна функция.
• Оптимизиране набиотехнологичните процеси чрез анализиране на метаболомни профили на микроорганизми, които могат да се използват за оптимизиране на ферментационни и производствени процеси за биологични продукти.

Биоинформатиката и метаболомиката се използват в различни области на медицината при идентифициране на биомаркери за рак, диабет и други заболявания; разработване на персонализирана медицина; откриване на нови лекарствени вещества във фармацията; при оценка на ефективността и безопасността на лекарствата; в хранително-вкусовата промишленост за оценка на качеството на храните, разработване на нови функционални храни; в агрономията за подобряване на добивите и устойчивостта на културите, разработване на нови сортове растения и в екологията за мониторинг на замърсяване на околната среда, и оценка на въздействието на изменението на климата.

Въпреки големия потенциал, комбинацията от биоинформатика и метаболомика все още е свързана с някои предизвикателства, като анализ на големи и сложни данни, стандартизация на данни и сложност при интегриране на геномни, транскриптомни, протеомни и метаболомни данни. Въпреки тези предизвикателства, бъдещето на биоинформатиката и метаболомиката изглежда обещаващо. С развитието на новите технологии и алгоритми тези две области ще продължат да играят все по-важна роля в разбирането на биологичните процеси и разработването на нови терапии и технологии.

7. ПРЕДИЗВИКАТЕЛСТВА И ПЕРСПЕКТИВИ ПРЕД ЕКОЛОГИЧНАТА МЕТАБОЛОМИКА

Екологичната метаболомика е интеграцията на метаболомиката и екологията за изучаване на взаимодействията между организмите и околната среда чрез изследване на метаболитни профили. Екологичната метаболомика е мост между организмите и околната среда. Тази сфера се развива бързо, но е изправена пред няколко предизвикателства и предлага уникални перспективи.

Въпреки големия потенциал на екологичната метаболомика, тя все още е изправена пред няколко предизвикателства, като сложността на екологичните системи и динамиката, което затруднява идентифицирането и количественото определяне на всички метаболити. Базите данни с метаболитни профили на различни организми и екосистеми все още са недоразвити; анализът на метаболомни данни изисква скъпо оборудване и специализирани софтуерни инструменти, а липсата на стандартизирани методи за вземане на проби, екстракция и анализ на метаболити затруднява сравняването на резултатите.

7.1. Приложение на микробната метаболомика – творческа протеомика

Микробната метаболомика и творческата протеомика са два мощни инструмента в съвременната микробиология, които ни позволяват да разберем по-добре сложните процеси, протичащи в микроорганизмите. Тези изследователски области са от голямо значение за няколко приложения, вариращи от медицина и фармацията до биотехнологиите и опазване на околната среда.

Творческата протеомика е сравнително нова област, занимаваща се с разработване и прилагане на нови методи за протеинов анализ. Целта е да се преодолеят ограниченията на традиционните протеомни методи и да се получи по-пълна картина на протеома на даден организъм.

Интегрирането на микробната метаболомика и творческата протеомика в изследванията предоставя възможност за по-задълбочено разбиране на клетъчните процеси. Чрез сравняване на промените в метаболомите и протеомите е възможно да се определи как промените в генната експресия влияят на клетъчния метаболизъм. Микробната метаболомика и творческата протеомика са мощни инструменти, които имат потенциала да революционизират различни области на науката и технологиите. Чрез комбинирането на тези две области могат да бъдат открити нови лекарства, да се разработят по-ефективни биотехнологии и да се решат важни екологични проблеми. Ключови области на приложение на микробната метаболомика и творческата протеомика са:

• Идентифициране и диференциране на микробни щамове чрез анализиране на уникалните метаболитни профили на различни щамове микроорганизми. Творческата протеомика помага да се идентифицират и диференцират тясно свързани щамове. Има важни последици за безопасността на храните, микробиологията на околната среда и клиничната диагностика.
• Микробната метаболомика предоставя цялостен преглед на метаболитните пътища, активни в микроорганизма. Тази информация може да се използва, за да се разбере как микроорганизмите взаимодействат с околната среда, реагират на стрес и произвеждат ценни метаболити.
• Творческата протеомика помага да се идентифицират потенциални мишени за лекарства чрез анализиране на метаболитни промени, предизвикани от антимикробни съединения и оценка на ефективността на нови антибиотици.
• Микробната метаболомика може да се използва в индустриалната биотехнология за оптимизиране на процесите на ферментация, подобряване на производството на биогорива и други биопродукти и проектиране на микроорганизми за специфични индустриални приложения.
• Анализът на микробния метаболом в проби от околната среда помага за оценката на въздействието на замърсителите върху микробните общности и мониторинга на здравето на екосистемите.

Предимствата на креативната протеомика са високата експертиза на учените, специализирани в микробната метаболомика, достъпът до съвременни аналитични инструменти и най-новите технологии, позволяващи индивидуални решения за специфични нужди. Използването на силата на микробната метаболомика, творческата протеомика, помага на изследователите да отключат потенциала на микроорганизмите и да решават основни проблеми в различни области, включително медицина, селско стопанство и екология.

8.2. Приложение на метаболомиката за характеризиране на токсичността на замърсителите на околната среда и рисковете от заболяване

Когато организмът е изложен на токсичен агент, неговият метаболизъм се променя, което води до промени в концентрациите на различни метаболити. Метаболомният анализ може да идентифицира тези промени и да предостави информация за механизмите на токсичност на замърсителя за увреждане на организма на клетъчно ниво. Той също така идентифицира специфични метаболити, които служат като експозиция на конкретен токсикант и дози индикатори, отговорни за увреждането. Съществена е информацията за влиянието на повишаването на концентрацията на замърсителя върху метаболитния профил на организма и кои органи и системи засяга.

Приложението на метаболомиката и творческата протеомика в областта на околната среда и здравето предоставя съществена информация за оценка на риска за човешкото здраве, свързан с излагането на замърсители на околната среда, като тежки метали, пестициди и индустриални химикали.

Фигура 4.4. Промени в метаболитния профил в отговор на излагане на замърсители. Профил на експресия на ген след излагане на клетки RAW 264.7 на стандартен материал от прахови частици (PM), NIST1648a, и PM с намалено съдържание на органична материя, LAp120, в сравнение с ефектите на липополизахарида (LPS).

Може също така да се разбере как замърсителите се натрупват в организмите и как това се отразява на техния метаболизъм. Могат да бъдат идентифицирани нови замърсители, които причиняват промени в метаболизма. Тези метаболомни промени, свързани с излагането на замърсители, могат да се използват за разработване на биомаркери за ранно откриване на заболявания, свързани с околната среда. Друга съществена роля е да се използва за оценка на ефективността на различни методи за ремедиация на замърсени почви и води.

• Излагането на замърсители на околната среда може значително да промени човешкия метаболом, което води до различни здравословни проблеми. Ключовите метаболитни промени могат да бъдат маркери за няколко човешки заболявания, като например:
• Замърсители като прахови частици (PM2.5) и озон (O3) могат да предизвикат оксидативен стрес, водещ до повишени нива на реактивни кислородни видове (ROS). Това може да увреди липидите, протеините и ДНК, което води до повишени продукти на липидна пероксидация (напр. малондиалдехид), продукти на протеиново окисление и ДНК адукти.
• Активиране на възпалителни пътища, което води до повишени нива на възпалителни цитокини (напр. TNF-α, IL-6) и хемокини. Тези молекули могат допълнително да допринесат за оксидативен стрес и увреждане на тъканите.
• Нарушаване на енергийния метаболизъм, което води до промени в метаболизма на глюкозата, липидите и аминокиселините, което променя нивата на кръвната захар, мастни киселини, холестерол и аминокиселини.
• Повлияват метаболизма на невротрансмитерите, което води до промени в нивата на невротрансмитери като допамин, серотонин и глутамат, което води до неврологични и психиатрични разстройства.
• Възпрепятства сигнализирането на хормоните, което води до промени в нивата на хормони като естроген, тестостерон и хормони на щитовидната жлеза и оказва значително влияние върху репродуктивното здраве и развитие.
• Промените в липидния метаболизъм и оксидативния стрес могат да увеличат риска от атеросклероза и сърдечно-съдови заболявания.
• Предизвикват възпаление и оксидативен стрес в белите дробове, което води до респираторни заболявания като астма и хронична обструктивна белодробна болест (ХОББ).
• Промените в метаболизма на невротрансмитерите могат да допринесат за невродегенеративни заболявания като болестта на Алцхаймер и Паркинсон, както и психиатрични разстройства като депресия и тревожност.
• Някои замърсители могат директно да увредят ДНК, което води до мутации, които могат да допринесат за развитието на рак.
• Излагането на замърсители по време на бременност и ранна детска възраст може да има неблагоприятни ефекти върху развитието на плода и детето, включително нарушена когнитивна функция и респираторно развитие.

Точната оценка на експозицията на замърсители е от решаващо значение за разбирането на въздействието на замърсяването върху здравето. Намаляването на емисиите на замърсители чрез регулации и технологичен напредък е от съществено значение за смекчаване на рисковете за здравето, свързани със замърсяването.

Метаболомиката се оказва мощен инструмент за изследване на ефектите на замърсителите върху живите организми. Чрез анализиране на метаболитни промени учените могат да получат ценна информация за механизмите на токсичност, да идентифицират биомаркери на експозиция и да оценят рисковете за човешкото здраве. В бъдеще метаболомиката ще играе все по-важна роля в разработването на ефективни стратегии за опазване на околната среда и подобряване на човешкото здраве.

9. ЛИТЕРАТУРА

Adams, M. (2023). Metal Contamination Causes Metabolic Stress in Environmental Bacteria. Biological and Environmental Research https://www.energy.gov/science/ber/articles/metal-contamination-causes-metabolic-stress-environmental-bacteriaBooth, S., Turner, R.J., Weljie, A. ‘(2013). Metabolomics in Environmental Microbiology John Wiley & Sons, Ltd. 2, doi: 10.1002/9780470034590.emrstm1335

Chien, H.-Ju, Zheng, Y.-F., Wang, W.-C., Kuo, C.-Y., Li, S.-Y., Lai, C.-C. (2022). Chapter 6 – Application of proteomics and metabolomics in microbiology research. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. Designer Microbial Cell Factories: Metabolic Engineering and Applications., 107-129 doi.org/10.1016/B978-0-323-88504-1.00007-8

Danczak, R.E., Chu, R.K., Fansler, S., Goldman, A.E., Graham, E.B., Tfaily, M.M., Toyoda, J., Stegen, J.C. (2020). Using metacommunity ecology to understand environmental metabolomes. Nature communications 11 6369  https://doi.org/10.1038/ s41467-020-19989-y

Deng, P., Li, X., Petriello, M.C., Wang, C., Morris, A.J., Hennig, B. (2019. Application of metabolomics to characterize environmental pollutant toxicity and disease risks. Rev Environ Health 34, 3, 251–259 10.1515/reveh-2019-0030

Dumas, T., Courant, F., Fenet, H. and Gomez, E. (2022). Environmental Metabolomics Promises and Achievements in the Field of Aquatic Ecotoxicology: Viewed through the Pharmaceutical Lens. Metabolites 12, , 186. https://doi.org/10.3390/metabo12020186

Jan, S. and Ahmad, P. (2020). Chapter 5 – Instrumentation Applied to Metabolomic Analysis Ecometabolomics https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814872-3.00005-9

Lankadurai, B.P., Nagato, E.G. and Simpson, M.J. (2013). Environmental metabolomics: an emerging approach to study organism responses to environmental stressors Environ. Rev. 21: 180–205 http://dx.doi.org/10.1139/er-2013-0011

Mansoldo, F.R.P., Garrett, R., Cardoso, V. da S., Alvesc, M.A., Vermelho, Alane B. (2022). Metabology: Analysis of metabolomics data using community ecology tools. Analytica Chimica Acta 1232, 340469 doi: 10.1016/j.aca.2022.340469

Mosier, A.C., Justice,N.B.,  Bowen, B.P, Baran, R.,  Thomas, B.C, Northen, T.R, Banfield, J.F. (2013). Metabolites associated with adaptation of microorganisms to an acidophilic, metal-rich environment identified by stable-isotope-enabled metabolomics. mBio 4 (2): e00484-12.

Pan, Y., Cheng, J.-H., Sun, D.-W. (2021). Metabolomic analyses on microbial primary and secondary oxidative stress responses. Compr Rev Food Sci Food Saf. 20 5675–5697 doi: 10.1111/1541-4337.12835

van der Velden, P.M..M. and Jansen R.S. (2023). Microbial Metabolomics: An Overview of Applications. Chapter 165–208   10.1007/978-3-031-39094-4_6

Yang, S-T., Liu, X., Zhang, Y. (2007). Chapter 4 – Metabolic Engineering – Applications, Methods, and Challenges. Bioprocessing for Value-Added Products from Renewable Resources New Technologies and Applications, 73-118. https://doi.org/10.1016/B978-044452114-9/50005-0