1. GİRİŞ
Transkriptomik, belirli koşullarda belirli bir hücre, doku veya organizmada kopyalanan genom parçaları olan RNA transkriptleri ile ilgilenir. Transkriptomik, gen ifade kalıplarını ve bunların düzenlenmesini ortaya çıkaran, böylece hücresel süreçlerin moleküler mekanizmalarına ışık tutan bir çalışmadır.
Çevresel transkriptomik, mikrobiyal toplulukların transkriptomlarını (mRNA) çevreden alır, etkileşimlerini ve bu toplulukların çevreyle etkileşimini daha iyi anlamaya çalışır. Mikrobiyal genetik potansiyeli biyojeokimyasal faaliyetleriyle ilişkilendirir. Çevresel transkriptomik daha da ileri giderek, mikrobiyal konsorsiyumlar tarafından getirilen ancak bireysel türlerden kaynaklanan ilgi çekici özelliklere veya işlevlere odaklanan araştırmaları araştırmaktadır.
Çevresel transkriptomik, topluluk düzeyinde ifade edilen gen türleri hakkında bilgi eksikliği ile bunu yapmaktadır. Bu yaklaşım, üyelerini kültüre etmeden mikrobiyal topluluk dinamiklerini takip etmeyi sağlar; sadece RNA’nın çıkarılmasını, dizilenmesini, transkriptom birleştirilmesini ve fonksiyonel ek açıklamayı gerektirir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın çevre biliminde moleküler düzeyde çeşitli uygulamalar için kullanılması vizyonu, mRNA ile çalışmanın teknik zorlukları nedeniyle engellenmektedir. Bilindiği üzere, prokaryotik transkriptler poliadenilasyon mekanizmasından yoksundur ve RNA izolasyonu ökaryotik olan kadar kolay değildir. mRNA’ların yarı ömrü çok kısadır (yaklaşık 30 saniye) ve mikrobiyal hücredeki toplam RNA havuzundaki göreceli bollukları çok düşüktür, bu da zayıf tespit sinyallerine neden olur.
Bu zorlukların üstesinden gelmek ve kısmi çevresel transkriptomların analizini kolaylaştırmak için protokoller geliştirilmiştir. Bunlar arasında, çevresel bir örnekten doğrudan RNA ekstraksiyonu (meta-transkriptomiktranskriptomik), RNA okumaları arasındaki mekânsal mekânsal ilişkileri koruyarak çevresel bir örnekten RNA ekstraksiyonu (), alt popülasyon ilişkilerini koruyarak çevresel bir örnekten RNA ekstraksiyonu (sıralanmış transkriptomik) sayılabilir. Kantitatif ekolojik araştırmalar için gerekli olan fonksiyonel genlerin topluluğa özgü dizilerinin elde edilmesini, bilinen mikrobiyal süreçler için yeni hipotezler üretilmesini veya doğal mikrobiyal toplulukların genetik potansiyelinin ve aktivite modellerinin değerlendirilmesini (çevresel genomiklerin yardımıyla ) araştıran umut verici çalışmalar da vardır.
2. BULGULAR
2.1. Kısmi çevresel transkriptomların analizi için protokol
Kısmi çevresel transkriptomların analizi için temel protokol aşağıdaki ana adımlardan oluşmaktadır (Şekil 7.1):
- Çevresel bir örnekten toplam RNA ekstraksiyonu;
- rRNA transkriptlerinin azaltılması için mRNA için zenginleştirme;
- Rastgele astarlanmış ters transkripsiyon ile cDNA şablon popülasyonunun sentezi;
- cDNA klon kütüphaneleri oluşturmak için şablonların PCR ile amplifikasyonu;
- cDNA klonlarının sekanslanması;
- Transkript ek açıklaması: referans genomlara karşı eşleme veya de novo assembly kullanarak yapıların birleştirilmesi;
- Transkript yapılarını kullanarak türleri atayın ve taksonomik gösterim yapılması;
- (isteğe bağlı) Ortaya çıkan proteinlerin varlığını ve işlevlerini ortaya çıkarmak için çeviri ve işlevsel analizler.
Çevresel numunelerin doğası çok karmaşık olduğundan, numunelerin toplanması ve işlenmesine ilişkin parametrelerin dikkatle seçilmesi gerekmektedir. İki husus göz önünde bulundurulmalıdır: 1) örnekteki türlerin bilinmeyen sayısı ve 2) bireysel (ve potansiyel olarak yeni) türlerin bilinmeyen göreceli payı. Bu nedenle, dikkat edilmesi gereken temel önlemler şunlardır
- Örneklem büyüklüğünün seçimi;
- İşleme yöntemi seçimi
- RNA ekstraksiyon tekniğinin lizis teknikleri, lizis tamponları, örnek saklama, DNAse işlemi vb. açısından optimizasyonu;
- RRNA içeriğini düşürerek (örneğin, subtraktif hibridizasyon ile) veya mRNA izolasyonu ile RNA zenginleştirme
- Okumaların uzunluğuna ve hedef moleküle (cDNA veya RNA) bağlı olarak uygun sekanslama yönteminin seçimi: kısa okunan cDNA, uzun okunan cDNA ve uzun okunan doğrudan RNA;
- (de novo) Transkriptom birleştirmesi – mevcut referans veritabanlarını seçin;
- Birleştirilmiş ve açıklanmış transkriptleri (yaklaşık olarak da olsa) bir türü (takson) temsil eden kümeler halinde gruplama alıştırması yapın. İyi çalışılmış diziler arasındaki homologları tanımlamak için dizi benzerliği araştırması yapın ve gruplandırmaya izin vermek için üretilen proteinlerin fonksiyonel ek açıklamalarını yapın.
Şekil 7.1. Kısmi çevresel transkriptomların analizi iş akışı (Kaynak: Mante vd., 2024).
Öğrenin: RNA nasıl etkili bir şekilde çıkarılır (video) ve RNA sorun giderme yöntemleri nelerdir (video)
Öğrenin: cDNA kütüphaneleri nasıl oluşturulur (video)
Öğrenin: ALLUMINA kısa okumalı cDNA dizileme (video)
3. ALTERNATİFLER (TARTIŞMA)
3.1. Transkripsiyonel heterojenliğin zorluklarının üstesinden gelmek
Çevresel habitatlardaki mikrobiyal konsorsiyumlar karmaşık ve dinamik bir sistem oluşturur ve bu nedenle transkriptomik veri üretimi ve yorumlanmasındaki tüm zorlukları taşırlar. Bakteriler çevresel değişikliklere, transkripsiyonel heterojenlikle sonuçlanan spesifik transkripsiyonel programları aracılığıyla yanıt verirler. Aslında bu heterojenlik çok daha karmaşıktır çünkü genetik olarak aynı olan popülasyonlarda bile bireylerin transkripsiyonel profilleri benzersiz olabilir. Örneğin antibiyotik tedavisine direnç gösteren bakteriler veya substrat açlığı koşullarında ortaya çıkabilen metabolik olarak özelleşmiş hücreler için durum böyledir. Çevresel örneklerin kalıtsal transkripsiyonel heterojenliği, mikrobiyal topluluklardaki transkripsiyonel durumların profilini çıkarmayı zahmetli bir iş haline getirmektedir. Bu engelin üstesinden gelmek için akılcı bir yaklaşım, karmaşık bir sistemdeki binlerce hücrenin eşzamanlı olarak karakterize edilmesini sağlayan dizileme metodolojilerinin geliştirilmesidir.
Şu anda, hepsi tek hücreli RNA’nın dizilenmesine dayanan çeşitli yüksek verimli metodolojiler mevcuttur. Bunların çoğu, ters transkripsiyon aşaması ve mRNA yakalama boncuklarının yardımı gibi dizileme sürecinin başlarında hücresel mRNA’nın barkodlanmasını içerir. Bu teknikler, dizileme sürecinin tek hücre çözünürlüğü özelliğini desteklemektedir.
MATQ-seq, tek hücreleri çok kuyucuklu plakaların ayrı kuyucuklarına izole eder ve dizileme kütüphaneleri oluşturmak için ayrı dizinleme reaksiyonları gerçekleştirir. Bu ‘indeksleme’ şeması, total RNA sekanslama için oldukça hassas bir kantitatif yöntemdir. Tek hücrelerin tüm transkriptomları arasındaki küçük genetik varyasyonları yakalamaya izin verdiği için çoğu tek hücreli RNA dizileme deneyinin doğasında bulunan düşük hassasiyet ve yüksek teknik ‘gürültünün’ üstesinden gelir. MATQ-seq prosedürü Şekil 7.2’de gösterilmektedir.
Şekil 7.2. MATQ-seq işlem hattı (Kaynak: Sheng ve Zong, 2019).
Paralel Sıralı Floresan İn Situ Hibridizasyon (par-SeqFISH), gen ekspresyonunu yüksek çözünürlükte konumsal bir bağlamda ortaya çıkaran bir transkriptom görüntüleme yaklaşımıdır. Protokol, çeşitli koşullar altında bir planktonik ve biyofilm kültüründe fırsatçı patojen Pseudomonas aeruginosa ile test edilmiş ve planktonik kültürün çeşitli metabolik ve virülansla ilgili durumlarına karşılık gelen transkriptleri tanımlamıştır. Bu teknikler ayrıca hedef hücrenin uzamsal konumuna bağlı olarak biyofilm kültüründe farklı fizyolojik durumların bir arada var olduğunu göstermiştir (Şekil 7.3). Bu sonuçlar mikrobiyal popülasyonların karmaşık dinamiklerini ve bunların yüksek hassasiyetle incelenmesinin önemini vurgulamaktadır.
Şekil 7.3. par-SeqFISH yöntemi prensibi (Kaynak: Dar ve ark., 2021).
PETRI-seq, RNA’yı yerinde etiketleyerek ve ardından dizileme yaparak prokaryotik ifade profilinin çıkarılmasını sağlayan bir tekniktir. Bu, on binlerce bireysel bakteri hücresinin eşzamanlı olarak barkodlanması için kombinatoryal indekslemeyi kullanan uygun maliyetli ve yüksek verimli bir protokoldür. Hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif temsilcilerle uyumludur ve çeşitli bakteriyel metabolik durumlar/büyüme aşamaları için yüksek ayırt edici değerler gösterir. Bu teknik, karmaşık mikrobiyal topluluklardaki hücresel dinamiklerin değerlendirilmesi için uygundur.
3.2. E-DNA örneklerinde mikrobiyal gen transkriptlerinin uygulamaları
Kantitatif ekolojik çalışmalar, çevresel sorunlarla yüzleşmek için gelişmiş matematiksel ve istatistiksel araçlar kullanır. Çevresel transkriptomik, topluluğa özgü fonksiyonel gen dizilerini elde etme kabiliyeti nedeniyle bu anlamda katkıda bulunabilir. Doğal ortamlardaki fonksiyonel genlerin keşfi, veri tabanlarındaki mevcut bilgilere dayalı olarak primerlerin tasarlanmasını gerektirir. Ancak bu yaklaşım yalnızca kültüre alınmış mikroorganizmalar için işe yaramaktadır. Çevresel transkriptomik, yani transkript kütüphaneleri, bu sorunu çözmeye yardımcı olabilir, çünkü dizi bilgileri hakkında önceden bilgi sahibi olmadan aktif hücrelerden bölgeye özgü fonksiyonel gen dizileri sağlarlar. Ayrıca, çevresel transkriptomik, belirli koşullar altında aktif olarak ifade edilen çeşitli genler için gen dizileri sağlar. Bunlar arasında, biyojeokimyasal açıdan ilgi çekici gen dizileri bulunabilir ve hedef biyoteknolojik amaçlar için daha fazla kullanılabilir.
Çevresel proteomik, mikrobiyal süreçler hakkında yenilikçi hipotezler üretme potansiyeline de sahiptir. Çevresel transkriptomik protokolü kullanılarak belirli organizmaları, belirli filojenik grupları veya metabolik modelleri belirlemeye gerek kalmadan mikrobiyal gen ifadesi için farklı topluluk türleri araştırılabilir. Otomatik ek açıklamanın güçlü araçları, bu çok odaklı araştırma yaklaşımını doğal mikrobiyal konsorsiyum değerlendirmesinin genetik potansiyeli ve faaliyet modelleriyle birleştirebilir.
Çevresel mikrobiyal gen transkriptlerinin bir başka umut verici uygulaması da ekosisteme özgü referans veri tabanlarının oluşturulmasıdır. Belirli bir ekosistemin sekanslarını içeren bu tür küçük veritabanları zaten oluşturulmuştur – bir AAT’deki mikroflora için MiDAS 2.0 veritabanı ve Dictyopteran bağırsağı için referans veritabanı – DictDb. Ekosisteme özgü veri tabanı örnekleri şunlardır:
- İnsan bağırsak sistemi 16S taksonomik veritabanı ( HITdb );
- İnsan oral mikrobiyom veritabanı (HOMD)
- Tatlı suya özel veritabanı ( FreshTrain )
- Bal arısı bağırsak mikrobiyota veritabanı
- Rumen ve bağırsak metanojen veri tabanı
Bu referans veri tabanları amplikonların hızlı ve uygun bir şekilde sınıflandırılmasına katkıda bulunsa da, kural olarak sınırlı sayıda sekans içerirler. Bu engel, aynı anda iki referans veritabanı kullanarak amplikonları sınıflandırabilen özel bir algoritmanın geliştirilmesiyle aşılmıştır. Bunlardan ilki evrensel bir veri tabanı, ikincisi ise küçük bir ekosistem veri tabanıdır. TaxAss adlı algoritma ücretsiz ve açık kaynak kodludur. Buna göre protokol, tanımlanmış bir özdeşlik yüzdesine sahip diziler için bir çöp tutma belirlemek için ekosisteme özgü veritabanına karşı amplifikasyon ve eşleme ile başlar ve bundan sonra çöp tutma üzerinde olanlar evrensel veritabanına doğru sınıflandırılır. Bu algoritmanın uygulanmasıyla yüksek bir sınıflandırma oranı elde edilir. Bununla birlikte, yakın ilişkili diziler eşiğin her iki tarafından da düşebilir ve bu nedenle oldukça farklı taksonomilere atanabilir.
Mevcut referans veri tabanları milyonlarca yüksek kaliteli referans dizisini kapsamaktadır. Bu veri tabanları, yüksek kimlik ve bir habitattaki gerçek çeşitliliğin geniş kapsamı ile karakterize edilir. Önümüzdeki bir görev de kültürlenmemiş taksonlar için taksonomik atamaların iyileştirilmesidir. Yedi taksonomik derecenin tamamını kapsayan ekosisteme özgü taksonomilerin oluşturulmasına olanak tanıyan AutoTax adlı bir yazılım aracı bulunmaktadır. Bu yazılım, her bir taksonomik kademe için çöp tutucuları tanımlamak üzere dizilerin de novo kümelenmesini kullanarak sınıflandırılmamış taksonlar için isimler sağlar. De novo kümeleme basitleştirilmiştir; bu nedenle, ek referans dizileri ile veritabanı genişletme durumlarında da yer tutucu adlar korunur.
TaxAss ve AutoTax veritabanlarını keşfedin
4. ÇÖZÜMLER
4.1. Kombinatoryal barkodlama ile tek hücreli transkriptomik
Bu yöntemlerden biri, damlacık tabanlı hücre yakalama ve barkodlamayı araştıran yöntemlere atfedilen maliyet etkinliği, performansın taşınabilirliği ve iyi ölçeklenebilirlik sunmak için tasarlanmış Seq-Well yöntemidir. Bu yöntemde hücreler, yerçekimini takiben ‘pico’ boyutlarındaki bir dizinin kuyucuklarına yüklenir ve karşılık gelen transkriptleri benzersiz bir şekilde barkodlanır. Picowell dizisi daha sonra RNA sızıntısını sınırlarken hücre lizisi boyunca sıvıların kolay değişimine izin veren yarı geçirgen bir membran ile kapatılır (Şekil 7.4). Başlangıçta klinik uygulama için geliştirilen bu yöntem, çevresel mikrobiyal konsorsiyumlar gibi herhangi bir karmaşık tek hücreli topluluğun transkriptom analizi için kullanılabilir.
Şekil 7.4. Seq-Well tekniği (Kaynak: Gierahn etal., 2017)
Son zamanlarda, ikinci bir PCR priming bölgesi oluşturmak için ters transkripsiyondan sonra ikinci iplik sentezi [İkinci İplik Sentezi için 3] adımını içeren Seq-Well yönteminin yükseltilmiş bir versiyonu olan Seq-Well3 geliştirilmiştir. Sonuç olarak, ters transkripsiyonlu ancak şablon değiştirme reaksiyonunun performansı olmadan cDNA geri kazanılır. Böylece, transkripsiyon faktörleri ve sinyal molekülleri gibi temel transkriptlerin yakalanması 10 kata kadar artırılır.
Seq-Well3 adım adım protokolünü buradan takip edin
4.2. Poli(A)-bağımsız tek hücreli RNA dizilimi
Poli(A)-bağımsız tek hücreli RNA dizileme, RNA’nın tüm sınıfları ve genomik bölgeleri için çalışabilen bakterilerde büyümeden bağımsız gen ekspresyon modellerinin ortaya çıkarılmasına olanak tanıyan bir tek hücreli RNA dizileme protokolüdür. Protokol bireysel Salmonella ve Pseudomonas bakterileri için test edilmiştir ve umut verici sonuçlar diğer bakteri türleri ve/veya çevresel mikrobiyal konsorsiyumlar için bir referans noktası olarak hizmet edebilir.
Poly(A)-bağımsız tek hücreli RNA seq hakkında daha fazla bilgiyi buradan edinebilirsiniz
4.3. Prob tabanlı bakteriyel tek hücre RNA dizilemesi
Prob tabanlı bakteriyel tek hücre RNA dizilimi (ProBac-seq), izojenik bakteri popülasyonlarının transkripsiyonel heterojenliğini tek hücre düzeyinde ortaya çıkarmak için tasarlanmıştır. Protokol prob tabanlıdır ve tek hücreli RNA dizilemesi gerçekleştirmek için DNA prob kütüphanelerinden ve mikroakışkan ticari platformlardan yararlanır. Bakterilerin Gram durumuna bakılmaksızın tek bir deney sırasında binlerce bireysel bakteri transkriptomunun dizilenmesine izin verir
Şekil 7.5. ProBac-seq tekniği prensibi (Kaynak: McNulty vd., 2024).
Yöntem E. coli ve B. subtilis için onaylanmıştır. Ayrıca, farklı çevresel koşullara maruz kalan çeşitli alt popülasyonlarda toksin ekspresyonunun heterojenliğini incelemek için Clostridium perfringens ile test edilmiş ve patojenite ile ilişkili metabolik pertürbasyonların tespitinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır.
Prob tabanlı bakteriyel tek hücre RNA seq hakkında daha fazla bilgiyi buradan edinebilirsiniz
4.4. Bakteriyel tek hücre RNA dizilemesi için in situ kombinatoryal indeksleme
Mikrobiyal split-pool ligasyon transkriptomiği (microSPLiT) hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif bakterilere uygulanabilen ve farklı transkripsiyonel durumları çözebilen bir tekniktir. Teknik, farklı aşamalara kadar büyütülen Bacillus subtilis hücreleri ile onaylanmış ve bakteri yaşamı boyunca çeşitli metabolik değişikliklere karşılık gelen bir dizi metabolik model ortaya çıkarmıştır (Şekil 7.6)
Şekil 7.6. microSPLiT tek hücre dizileme yöntemi prensibi (Kaynak; Gaisser ve ark., 2024)
Bu çalışma sırasında, bilinen ancak nadir durumlara (hücresel yeterlilik ve profaj indüksiyonu) karşılık gelen çeşitli ifade profilleri tanımlanmıştır. Ayrıca, aralarında metabolik yolların heterojen bir şekilde (belirli hücre alt popülasyonlarında) aktivasyonunun da bulunduğu beklenmedik gen ifadesi durumları tespit edilmiştir. Dolayısıyla, microSPLiT fenotipik olarak farklı alt popülasyonların tespiti için iyi bir karardır.
microSPLiT RNA dizileme yöntemi hakkında daha fazla bilgiyi buradan edinebilirsiniz
5. KAYNAKLAR
Blattman, S.B., Jiang, W., Oikonomou, P. et al. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nat Microbiol 5, 1192–1201 (2020). https://doi.org/10.1038/s41564-020-0729-6
Dar, D., Dar N., Cai L., and Newman D.K. Spatial transcriptomics of planktonic and sessile bacterial populations at single-cell resolution (2021) Science, 373, 6556, DOI: 10.1126/science.abi4882
Gaisser, K.D., Skloss, S.N., Brettner, L.M. et al. High-throughput single-cell transcriptomics of bacteria using combinatorial barcoding. Nat Protoc (2024). https://doi.org/10.1038/s41596-024-01007-w
Gierahn, T., Wadsworth, M., Hughes, T. et al. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput. Nat Methods 14, 395–398 (2017). https://doi.org/10.1038/nmeth.4179
Imdahl, F., Vafadarnejad, E., Homberger, C. et al. Single-cell RNA-sequencing reports growth-condition-specific global transcriptomes of individual bacteria. Nat Microbiol 5, 1202–1206 (2020). https://doi.org/10.1038/s41564-020-0774-1
McNulty, R., Sritharan, D., Pahng, S.H. et al. Probe-based bacterial single-cell RNA sequencing predicts toxin regulation. Nat Microbiol 8, 934–945 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01348-4
Mante J. Groover, K. E., Pullen R. M. Environmental community transcriptomics: strategies and struggles. (2024) Briefings in Functional Genomics, 1–15, https://doi.org/10.1093/bfgp/elae033
Page, T. M. and Lawley J. W. (2022) Front. Mar. Sci., Sec. Marine Molecular Biology and Ecology, 9 – 2022 https://doi.org/10.3389/fmars.2022.757921
Poretsky R.S, N. Bano, A. Buchan, G. LeCleir, J. Kleikemper, M. Pickering, W.M. Pate, M.A. Moran, J.T. Hollibaugh. Analysis of microbial gene transcripts in environmental samples. Appl Environ Microbiol. 2005 71(7):4121-6. doi: 10.1128/AEM.71.7.4121-4126.2005.
Wang, B., Lin, A.E., Yuan, J. et al. Single-cell massively-parallel multiplexed microbial sequencing (M3-seq) identifies rare bacterial populations and profiles phage infection. Nat Microbiol 8, 1846–1862 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01462-3.
