1. GİRİŞ
Transkriptomik, transkriptomun (bir örnekteki toplam RNA molekülleri kümesi) incelenmesi, hücresel süreçler, gen ifadesi ve düzenleyici mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. 1990’lardaki başlangıcından günümüze, bu alan, büyük ölçekli analizlere olanak tanıyarak ve daha önce elde edilemeyen değişiklikleri tespit ederek gen ifadesi çalışmasında devrim yaratan yeni nesil dizileme (NGS) ve RNAseq’in geliştirilmesiyle önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu teknoloji, model olmayan organizmalar ve önceden genomik kaynakları olmayan türler üzerindeki araştırmaları genişletmiştir. Ekolojide transkriptomik, aşağıdaki gibi ekolojik açıdan önemli özelliklerin araştırılmasına yardımcı olur:
- zorlu ortamlara karşı direnç
- hastalık veya enfeksiyon direnci
- yaşam öyküsü, gelişim ve plastisite
- türlerin adaptasyonu
Fizyolojik verilerle entegre edildiğinde, transkriptomik ekolojik soruları incelemek için çok boyutlu bir yaklaşım sunmaktadır.
2. ARAZİ TRANSKRİPTOMİĞİ – TEMELLER
2.1. Arazi transkriptomiği nedir
Arazi transkriptomiği, genom çapında gen ifadesinin çevresel varyasyonu organizma işlevine ve popülasyonlar arasındaki genetik farklılaşmaya nasıl bağladığını incelemektedir. Arazi transkriptomiği, arazi ekolojisi, makrosistem biyolojisi, arazi genomiği, ekofizyoloji ve karşılaştırmalı transkriptomik ilkelerini bütünleştirir.
Arazi genomiği üzerine yapılan çok sayıda inceleme, DNA dizisi varyasyonunu incelemenin ötesine geçen diğer arazi genomiği yaklaşımlarının potansiyelinden kısaca bahsetmiştir (Şekil 2.1.). Bu yaklaşımların her biri, popülasyonların arazi ölçeğindeki süreçlere nasıl tepki verdiğine dair anlayışımızı geliştirebilirken, transkriptomik, bazı farklı zorluklar sunarken zengin bir benzersiz bilgi kaynağı sunmaktadır. Dahası, transkriptomik teknikler yüksek verimli, standartlaştırılmış ve çeşitli organizmalarda yaygın olarak uygulanabilir olacak şekilde geliştirilmiştir, bu da bu yaklaşımı diğer bazı -omik yaklaşımlardan daha erişilebilir hale getirmektedir.
Şekil 2. 1 . Gen ifadesine yönelik omik-farklı yaklaşımlar (Kaynak: Supplitt ve ark., 2021)
2.2. Ekoloji, evrim ve koruma yaklaşımlarında arazi transkriptomiği
Arazi transkriptomiği, ekologlar, fizyologlar, evrimsel biyologlar ve koruma biyologları ile ilgili bir dizi soruyu yanıtlamak için benzersiz bir konuma sahiptir ve aşağıdaki bölümlerde ele alınmaktadır
2.2.1. Çevresel faktörler ile uyumlu transkriptom değişimleri
Arazi transkriptomiği, biyotik ve abiyotik faktörlerin zaman içinde organizma tepkilerini nasıl etkilediğini anlamak için arazi ekolojisini fonksiyonel genomik ve ekofizyoloji ile birleştirir. Popülasyon dağılımları, gen ifadesi ile karmaşık şekillerde etkileşime giren abiyotik faktörler (örn. sıcaklık, yağış, kirleticiler) ve biyotik faktörler (örn. predatörler, rakipler, hastalıklar) tarafından şekillendirilmektedir. Farklı şekilde ifade edilen genlerin, işlevsel grupların ve birlikte ifade ağlarının belirlenmesi, mekansal ve zamansal ölçeklerde biyoçeşitliliği yönlendiren moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlamaktadır.
Hem makro hem de mikroorganizmalarda filogenetik akrabalık ve ekolojik benzerlik arasında bir korelasyon gözlemlenmiştir. Yakın akraba türler, benzer koşullar altında hayatta kalmayı sağlayan (çevresel filtreleme) benzer gen setlerini (özellik koruma) paylaşmaktadır. Böylece, genomlar temel nişleri tanımlar ve çevresel faktörlerin yanı sıra gerçekleşen nişleri tahmin etmektedir.
Transkriptomik çalışmaları arazilere ölçeklendirmek, daha küçük ölçekli çalışmalarda gösterildiği gibi, çıkarım gücünü artırmak için tekrarları artırmayı ve karıştırıcı değişkenleri en aza indirmeyi içermektedir:
– Kırsal ve kentsel ortamlarda Parus major (Büyük memeliler) çalışmaları. Watson ve arkadaşları, 2017, iki farklı büyük memeli (Parus major) popülasyonundan transkriptomların karakterizasyonunu amaçlayan bir deney gerçekleştirmiştir: kentsel ve kırsal. Çalışma verileri, hedef araştırma bölgeleri olan kan ve karaciğerin gen ekspresyon profilleri arasında büyük bir fark olduğunu ortaya koymuştur. Farklı şekilde ifade edilen genler organizmanın bağışıklık ve yangısal tepkilerini, detoksifikasyonunu, oksidatif stresten korunmasını, lipid metabolizmasını ve gen ifadesi düzenlemesini yansıtmaktadır. Ayrıca, stres tepkileriyle bağlantılı genlerin kentsel popülasyonda kırsal popülasyondaki muadillerine göre daha güçlü bir şekilde ifade edildiği bulunmuştur. Bu veriler, kentsel koşullar altında yaşayan hayvanların daha güçlü çevresel stres faktörlerine maruz kaldığı sonucuna varmakta ve epigenetiği çevresel kaynaklı fizyolojik varyasyonların bir aracısı olarak vurgulamaktadır. Bu pilot çalışma, kentsel bağlamda fenotipleme varyasyonunu yönlendiren mekanizmalara odaklanan daha derinlemesine araştırmaların tasarlanması için sağlam bir arka plan olarak kabul edilebilir. Buna ek olarak, vahşi doğada kentsel stres faktörlerine yanıt olarak fenotipin moleküler düzeyde düzenlenmesi hakkında bilgi birikimi sağlanmıştır.
– Tarımsal ve tarım dışı alanlarda Bombus terricola (Bombus arısı) çalışmaları. Tsvetkov ve arkadaşları (2021) tarafından gerçekleştirilen çalışmada, tarımsal ve tarım dışı alanlardan oluşan bir model sistemde bombus arısı (Bombus terricola) popülasyonunu incelemek için bir koruma genomiği yaklaşımından yararlanılmıştır. Her iki alandaki işçilerin karınlarından seçilen RNA örnekleri dizilenmiş ve transkripsiyonel profiller tanımlanmıştır. Pestisitlere maruz kalma ve patojen enfeksiyonları ile bir ilişki göstermişlerdir. Ayrıca, meta- transkriptomik analizler düzenlenmiş ve üçü bombus ve bal arıları için ortak olan beş patojen tespit edilmiştir. Bu veriler, pestisitlerin ve patojenlerin bombus arısı popülasyonlarına yayılmasının yerleşik olumsuz rolü için işlevsel destek sağlamıştır. Ayrıca, koruma genomiğinin vahşi doğadaki tozlayıcı popülasyonları üzerinde çoklu stres faktörlerinin karmaşık etkilerinin ölçülmesine izin veren bir araç olarak rolünü kanıtlamaktadır.
2.2.2. Popülasyon düzeyinde çevresel değişikliklere transkriptomik yanıtlar
Çevresel tepkilerdeki popülasyon farklılıkları üzerine yapılan araştırmalar, evrimin tekrarlanabilirliğini, varyasyonu sürdüren süreçleri ve adaptif evrimde plastisitenin rolünü araştırmaktadır. Bu bilgiler, destekli göç ve habitat veya iklim değişikliğine karşı popülasyon tepkileri gibi uygulamalı zorlukların ele alınması için hayati önem taşımaktadır. Arazi transkriptomiği, özellikle de transkriptomiğin farklı genotiplerin çevresel faktörlere nasıl tepki verdiğini ortaya koyduğu genotip-çevre etkileşimlerinin (GxE) olduğu durumlarda genetik farklılıkları çevresel koşullara bağlayarak türlerin korunmasına ve popülasyon yönetimine yardımcı olmaktadır. Popülasyonlar, esneklik için kilit bir özellik olan temel gen aktivitesi veya transkripsiyonel plastisite yoluyla uyum sağlayabilir, ancak transkriptomların dinamik doğası DNA çalışmalarına kıyasla zorluklar yaratmaktadır.
Anolis carolinensis ve A. cristellatus üzerinde yapılan çalışmalar, sıcaklığın ortamlar arasındaki gen ifadesi farklılıklarının önemli bir etkeni olduğunu ortaya koymuştur. Soğuk toleransındaki adaptif değişimler solunum verimliliği ile ilişkilendirilerek fizyolojik verilerin transkriptomiklerle eşleştirilmesinin değeri vurgulanmıştır.
2.2.3. Koruma uygulamaları yönetiminde transkriptom – çevre ilişkileri
Potansiyel stres faktörlerinin etkisini ölçmek, organizma biyolojisi, tür yönetimi ve koruma için çok önemlidir. Pestisit gibi kısa süreli strese maruz kalma, stres faktörü artık mevcut olmasa bile sağlığı, uzun ömürlülüğü ve zindeliği etkileyen kalıcı transkripsiyonel değişikliklere neden olabilir. Dahası, stres etkenlerine maruz kalma, stres sona erdikten sonraki nesillerde çeşitli mekanizmalar yoluyla gen ifadesini modüle edebilmektedir.
Arazi transkriptomiği, doğadan yakalanan örneklerin akut, kronik veya önceki stres maruziyetine tepkilerini verimli bir şekilde değerlendirerek, geniş coğrafi bölgelerdeki stres faktörlerinin belirlenmesine ve haritalanmasına yardımcı olmaktadır. Bu yaklaşım, birden fazla stres faktörünün eşzamanlı olarak izlenmesine, farklı stres tepkileri arasında ayrım yapılmasına ve ölümcül olmayan biyolojik olarak ilgili yöntemlerle uzun vadeli etkilerin değerlendirilmesine olanak tanır. Bu nedenle, transkriptomik işaretler yönetim ve koruma çabalarına rehberlik etmek için değerli veriler sağlamaktadır.
2.2.4. Pratik bağlamda arazi transkriptomiği
Son yirmi yılda moleküler araçlar ve dizileme teknolojilerindeki gelişmeler, hem model hem de model olmayan organizmalarda ekolojik ve evrimsel süreçlerin incelenmesinde devrim yaratmıştır. RNA dizilemesinin azalan maliyeti (örnek başına 200 doların altında), arazi genelinde büyük ölçekli transkriptom örneklemesini finansal olarak uygulanabilir hale getirerek işlevsel mekanizmaların arazi düzeyindeki süreçlerle bütünleştirilmesine olanak sağlamıştır.
Çevresel değişimler boyunca doğadan alınan transkriptom örneklemesi, hücresel tepkileri büyük ekolojik dinamiklere bağlar ve türlerin termal değişiklikler, kirleticiler ve biyotik etkileşimler gibi stres faktörlerine verdikleri tepkileri anlamak için kritik öneme sahiptir. Doğal çalışmalar nedensel çıkarımları zorlaştırabilirken, bunların kontrollü deneylerle birleştirilmesi çevresel etkileşimlere dair güçlü bir içgörü sunmaktadır. Arazi transkriptomiği, iklim değişikliği ve habitat bozulmasından etkilenen türler için hayati önem taşıyan politika ve koruma çabaları hakkında da bilgi vermektedir.
Türlerin birlikte bulunuşunu anlamak, bitki ekolojisinde temel bir konu olmaya devam etmektedir. RNA dizilimi, geleneksel özellik temelli yaklaşımları aşarak işlevsel çeşitliliğin ve tür içi varyasyonun ayrıntılı değerlendirilmesini sağlar. Komünite transkriptomiği, bir arada bulunan türler arasındaki işlevsel gen benzerliklerini karşılaştırarak, çeşitli ekosistemlerde türlerin birlikte bulunmasına ilişkin temel soruları ele almaktadır.
Modern metagenomik yöntemler, filosfer ve rizosferdeki bitki-mikrobiyal etkileşimleri anlayışımızı dönüştürmektedir. Bu teknikler mikrobiyom çeşitliliğini, mekânsal-zamansal değişimleri ve bunların bitki topluluğu yapısı ve dinamikleri üzerindeki etkisini ortaya çıkararak daha geniş ekolojik örüntüler hakkında fikir vermektedir.
3. VAHŞI SISTEMLERIN PEYZAJ TRANSKRIPTOMIĞI
“Doğal sistemler” genellikle model olmayan organizmaları veya doğal ortamlarında çalışılan geleneksel olmayan model organizmaları ifade eder. Bu ortamlar, kontrollü laboratuvar ortamlarında gözlemlenemeyen gen ifadesi modellerini ortaya çıkarmak için eşsiz bir imkân sunmaktadır.
Doğal ortamlardaki transkriptom çalışmaları, karmaşık ve dinamik çevresel uyaranlara yanıt veren tipik olarak sessiz genlerdeki yeni aktiviteyi ortaya çıkarmıştır. Çevresel zorluklar, bireyler ve popülasyonlar arasında gen ifadesindeki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Örneğin, Whitehead ve arkadaşları (2012) kirliliğe toleranslı ve naif F. heteroclitus popülasyonları arasındaki gen ifadesindeki farklılıkların yalnızca yüksek toksin seviyelerine maruz kaldıklarında ortaya çıktığını, nötr süreçlerin ise yanıt vermeyen gen ifadesi modellerini açıkladığını gözlemlemiştir. Bu durum, kontrollü koşullar bu farklılıkları gizleyebileceğinden, çevresel stresin adaptif farklılaşmayı ortaya çıkarmak için çok önemli olduğunu vurgulamaktadır.
Transkriptom çalışmaları, model olmayan organizmalarda yeni veya açıklanmamış transkriptleri de tanımlayabilir. Daphnia pulex’te, transkriptomun üçte birinden fazlasını oluşturan tanımlanmamış genler ekolojik uyaranlara karşı belirgin yanıtlar göstermiştir. Çalışma, gen çoğalmasını, özellikle çoğaltılan genler ortak düzenleyici yollarda etkileşime girdiğinde, hızlı farklılaşmaya neden olan kilit bir mekanizma olarak tanımlamıştır. Bu bulgular, organizmalar karmaşık doğal koşullarla karşılaşana kadar birçok gen işlevinin bilinmediğini vurgulamaktadır.
3.1. Tüm genom kantitasyon teknikleri ile yapılan çalışmalar
DNA mikro dizileri ve RNA dizilimi (RNAseq), vahşi popülasyonlarda genom çapında gen ifadesini incelemek için güçlü araçlardır. Bu teknolojiler, protein üretimini ve ekolojik süreçlerle şekillenen fenotipleri etkileyen mRNA’yı analiz eder. Gen ifadesini büyük ölçekte inceleyerek, araştırmacılar moleküler düzenlemeyi çevresel faktörlere verilen fenotipik tepkilere bağlayabilir ve ekolojik transkriptomun anlaşılmasını ilerletebilir. Bu yöntemler, doğadaki gen ifadesi varyasyonunun kapsamı, çevresel etkileri ve fenotipleri şekillendirmedeki rolü gibi temel soruları ele alarak genetik ve ekoloji arasındaki etkileşim hakkında fikir vermektedir. Bu iki temel teknik Tablo 2.1’de karşılaştırılmıştır. Performansları için kısa protokoller Tablo 2.2 ve Tablo 2.3’te özetlenmiştir.
Tablo 2.1 Mikroarray ve RNAseq Teknolojilerinin Karşılaştırılması
| Özellik | DNA mikroarray | RNA dizileme |
| Yaş ve yaygınlık | Daha eski ve köklü; analiz kolaylığı nedeniyle popüler | Genom çapında transkriptomik için daha yeni ve giderek daha popüler |
| Yöntem | Floresan etiketli ile hibridize etmek için bir yüzeye sabitlenmiş problar kullanır | RNA transkriptlerinden türetilen cDNA parçalarını okumak için yeni nesil dizileme kullanır |
| Platform güvenilirliği | Bilinen DNA dizilerine özgü önceden tasarlanmış problar gereklidir | Okuma uzunluğu, derinliği ve kalitesindeki platforma özgü sekanslama farklılıkları dikkate alınmalıdır |
| Girdi malzemesi | floresan boyalarla etiketlenmiş mRNA’dan ters transkripsiyonlu cDNA | RNA transkriptlerinden oluşturulan cDNA kütüphanesi; sekanslanan |
| Çıktı verileri | Her probda cDNA bolluğu ile orantılı floresan yoğunluğu değerleri | Milyonlarca kısa okuma üreten yüksek verimli dizileme verileri |
| Analiz araçları | Ön işleme normalizasyon, logaritmik dönüşüm ve floresan sinyallerinin istatistiksel analizini içermesi | Kodlama dilleri kullanılarak ayrıştırılan veriler; referans genomlara hizalanması veya yazılım kullanılarak de novo olarak birleştirilmesi |
| Kapsam | Probların mevcut olduğu genlerle sınırlıdır; yeni transkriptleri tespit edemez | Genom çapında kapsam sağlar ve yeni transkriptleri tespit edebilir |
| Dinamik aralık | Daha dar; çok düşük veya çok yüksek ifade seviyelerini doğru bir şekilde ölçmekte zorlanabilir | Daha geniş; düşük ve yüksek oranda ifade edilen genleri tespit etmede ve nicelemede daha iyidir |
| Sapma | Prob tasarımı ve hibridizasyon verimliliği nedeniyle sinyal sapması mümkündür | Okuma derinliği, platforma özgü hatalar ve kütüphane hazırlama adımları nedeniyle potansiyel yanlılık |
| Uygulamalar | Bilinen gen üzerinde odaklanmış çalışmalar için idealdir | Keşif çalışmaları ve genom çapında transkriptom analizleri için uygundur |
| Maliyet ve karmaşıklık | Daha düşük maliyet ve daha basit iş | Hesaplama kaynakları gerektiren daha yüksek maliyetli ve daha karmaşık iş akışları |
Tablo 2.2 RNAseq Teknolojileri temel protokolü
Kaynak: https://www.youtube.com/watch?v=3hPyrQFTUuk&t=10s
| Adım | Performans |
| RNA dizileme nedir |  |
| Moleküler Biyoloji ve RNA’nın Merkezi Dogması |  |
| RNA dizileme – cDNA üretimi |  |
| Adım | Performans |
| RNA dizileme – RNA kütüphanesi oluşturma: RNA parçalanması ve 1. iplik cDNA sentezi | |
| RNA dizileme – RNA kütüphanesi oluşturma: RNA parçalanması & 2. iplik cDNA sentezi & A-kuyruk |  |
| RNA dizileme – RNA kütüphanesi oluşturma: adaptör ligasyonu ve amplifikasyonu |  |
| RNA dizileme uygulamaları |  |
Tablo 2.3 DNA Mikroarray (DNA çipi) temel protokolü.
Kaynak: https://www.youtube.com/watch?v=NgRfc6atXQ8
| Adım | Performans |
| DNA mikroarray nedir |  |
| DNA Mikroarray örnek hazırlama |  |
| DNA Mikroarray örnek hazırlama -cDNA sentezi ve floresan etiketleme |  |
| Adım | Performans |
| DNA Mikroarray çipi |  |
| DNA Mikroarray çip – oligonükleotid prob |  |
| DNA Mikroarray çipi – örnek yükleme |  |
| Adım | Performans |
| DNA Mikroarray çipi – örnek 1 hibridizasyonu (gen X) |  |
| DNA Mikroarray çipi – örnek 2 hibridizasyonu (gen Y) |  |
| DNA Mikroarray çip – örnek 1 + örnek 2 hibridizasyonu (gen Z) |  |
| DNA Mikroarray tespiti |  |
3.2. Evrimsel arka planda gen ifadesi varyasyonu
Gen ifadesindeki varyasyon kalıtsal olabilir ve hem adaptif hem de adaptif olmayan süreçleri yansıtan doğal seçilim tarafından şekillendirilebilir. Düzenleyici unsurlar veya epigenetik mekanizmalar genetik varyantlar ortaya çıkmadan önce ifadeyi etkileyebilir ve popülasyon düzeyindeki farklılıklar adaptif farklılaşmanın erken aşamalarına işaret edebilir. Çalışmalarda genellikle Qst-Fst karşılaştırmaları, McDonald-Kreitman testleri ve kantitatif özellik lokusları (QTL) haritalaması gibi testler kullanılarak adaptif süreçler nötr süreçlerden ayırt edilmektedir.
Hem nötr hem de adaptif süreçler gen ifadesini etkiler ve bunların rollerini filogenetik bir çerçevede incelemek, türlerdeki veya daha yüksek taksonomik seviyelerdeki farklılaşmayı anlamamıza yardımcı olabilir. Yakın akraba türlerin karşılaştırılması, özellikle çevresel zorluklara yanıt olarak türleşme için önemli genleri veya düzenleyici değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Örneğin, Chelaifa ve arkadaşları (2010) Spartina maritima ve Spartina alterniflora arasındaki transkriptomun %13’ünde, taşıyıcı, gelişimsel ve hücresel büyüme genleri de dahil olmak üzere, farklı nişleri işgal etme yeteneklerini destekleyebilecek farklı ifadeler bulmuştur.
Çalışmalar, doğal ortamlarda zaman, mekan ve filogenetik mesafe boyunca gen ifadesi varyasyonunu tanımlamıştır. Qst-Fst analizi gibi gelişmiş yöntemler, ifade kalıplarını şekillendirmede seçilim, sürüklenme veya darboğazların rollerini ölçmektedir. Doğadan örnekleme ile doğal üreme kaynaklarının (örneğin genetik haritalar) birleştirilmesi, özellikle farklılaşan veya yakın zamanda farklılaşmış popülasyonlarda gen ifadesi çeşitliliğini yönlendiren güçleri ortaya çıkarma yeteneğimizi artırır.
3.3. Çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ifadesi değişimi
Organizmaların abiyotik ve biyotik stres faktörleri de dahil olmak üzere çevresel uyaranlara nasıl tepki verdiğini anlamak, iklim değişikliği bağlamında kritik öneme sahiptir. Doğal ortamlardaki transkriptomikler, küçük çevresel değişikliklerin bile gen ifadesini önemli ölçüde etkileyebileceğini göstererek GxE etkileşimlerini ve fenotipik plastisitenin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmıştır. Örneğin, A. thaliana ve diğer türlerde yapılan çalışmalar, sıcaklık, yağış ve ozmotik stres gibi çevresel faktörlerin gelişim aşamaları boyunca transkripsiyonel varyasyonu etkilediğini göstermiştir.
Örnekleme tutarlılığı ve zamanlaması, güvenilir transkriptomik veriler için hayati önem taşımaktadır. Gen ifadesi zamansal ve çevresel değişkenlere karşı hassastır ve RNA’nın bozunmasını ya da parti etkilerini önlemek için dikkatli kullanım, muhafaza ve örnekleme zamanlarının dikkate alınmasını gerektirir. Bununla birlikte, transkriptom analizleri gen ifadesinin yalnızca bir “anlık görüntüsünü” sağlar, dinamik düzenleyici süreçleri yakalamak için zaman akışı çalışmaları gerekir, ancak bunlar maliyetli olabilir. Aday genler için qPCR gibi alternatif yaklaşımlar, zamansal değişiklikleri izlemek için daha pratik bir yol sunar.
İklim değişikliği verilerinin ekolojik transkriptomiklere dahil edilmesi, sıcaklık ve CO2 seviyeleri gibi gen ifadesi varyasyonunun itici güçlerinin belirlenmesine yardımcı olur. Pirinç ve soya fasulyesi gibi ürünlerde yapılan çalışmalar, iklim faktörlerine karşı transkripsiyonel tepkileri modelleyerek yabani popülasyonlar için de geçerli olabilecek içgörüleri ortaya koymuştur. PCA ve regresyon analizi de dahil olmak üzere gelişmiş yöntemler, transkripsiyonel değişiklikleri ekolojik bağlamlara bağlama yeteneğimizi geliştirerek türlerin iklim değişikliğine ve çevresel stres faktörlerine tepkilerine ilişkin tahminleri iyileştirmektedir.
3.4. Gen ifadesi ve fenotip ilişkisi
Gen ifadesinin ekolojide işlevsel bir rol oynaması için fenotipi etkilemesi gerekir. Çok az sayıda çalışma, fonksiyonel unsurlar ve fenotip arasındaki nedensel ilişkiyi ek protein veya metabolizma temelli deneyler, ilgili genleri devre dışı bırakarak veya ilgili genlerin transgenik ifadesi yoluyla doğrulamıştır (Tablo 2.4).
Tablo 2.4 Ekolojik Transkriptomik Alanındaki Temel Çalışmalar ve Gelişmeler: Fenotipik Farklılaşmadan Nedensel Gen İfadesi Bağlantılarına Doğru
| Kategori | Organizma | Temel bulgular | Referans |
| Alternatif fenotipler | C. clupeaformis (göl beyaz balığı) | Birlikte ifade ağı analizi, normal ve cüce formların beyin ve kas dokularında farklı gen modüllerini ortaya çıkardı | Filteau ve diğerleri, 2013 |
| Çevresel rahatsızlıklar | F. grandis
(körfez killifish) |
Petrol sızıntısı sonrası, > 1.500 farklı şekilde ifade edilen gen ve değişmiş solungaç morfolojisi; cyp1a gelişimsel sorunlarla bağlantılı | Whitehead ve diğerleri, 2011 |
| Stres adaptasyonu | S. cerevisiae (maya) | Bir SNP ve genom boyutu farklılıklarıyla bağlantılı tuz stresi altında adaptif uygunluk değişiklikleri, stres adaptasyonunda ifade evrimini ortaya çıkarmaktadır | Dhar ve diğerleri, 2011 |
| Gelişmiş ekolojik transkriptomik | S. cerevisiae (maya) | Gen aktarımları, ifade ağları ve özellikler arasındaki rastlantısal ilişkileri doğrulamıştır | Zhu ve diğerleri, 2008 |
Ekolojik transkriptomiği ilerletmek için, manipülatif teknikleri dahil ederek gen ifadesi ve özellik varyasyonu arasındaki korelasyonların ötesine geçmek çok önemlidir. RNAi ve CRISPR/Cas gibi gelişmekte olan araçlar geleneksel olmayan modellere zaten uygulanmıştır ve ekolojik olarak ilgili model olmayan türlere genişletilebilir. Bu tür yaklaşımlar, ekolojik transkriptomiği tanımlayıcı çalışmalardan süreçleri aydınlatan çalışmalara dönüştürerek genetik yollar ve bunların taksonlar arasındaki çeşitliliği hakkındaki anlayışımızı geliştirirken çevresel ve evrimsel teori hakkında bilgi verir.
4. ZORLUKLARI VE PERSPEKTİFLERİ
4.1. Transkriptomik verilerin toplanması, analizi ve açıklanması
Arazi transkriptomiği, her biri kendine özgü hususları olan çeşitli soruları ele alabilirken, transkripsiyon üzerindeki çevresel etkilerin izolasyonunu zorlaştıran çevresel değişkenlik ve bireysel varyasyon gibi bazı genel zorluklarla karşılaşılmaktadır. Sirkadiyen ritimler, gelişim yaşı, cinsiyet, üreme durumu ve bağışıklık/hastalık koşulları gibi faktörler çevresel tepkileri gizleyebilmektedir. Bu değişkenleri istatistiksel olarak veya örnekleme sırasında kontrol etmek daha büyük örnek boyutları ve daha yüksek maliyetler gerektirir. Ancak, dizileme maliyeti düşmeye devam etmektedir.
Popülasyonlar transkripsiyonel tepkilerde farklılık gösterebilir, bu da taramalar veya geçişler arasında iyi bir örnekleme yapılmasını gerektirir. Örnekleme stratejileri değişimleri dengelemelidir: arazi odaklı sorular için arazilere veya arazi içi varyasyon için bireylere öncelik verilmelidir. Simülasyon çalışmaları bu dengelerin kurulmasına yardımcı olabilmektedir.
Örneklerin bir yerde toplanması popülasyon ortalamalarını vurgular, ancak bireysel çeşitliliği küçümser, bazı sorulara uygundur, ancak hepsine uygun değildir. Dizileme maliyetlerinin azaltılması çalışmanın fizibilitesini artırır, ancak tasarımlar türlere ve araştırma hedeflerine uygun olmalı, yeterli çoğaltma ve gradyan temsili sağlanmalıdır.
Özet olarak, arazi transkriptomik çalışmaları için en iyi örneklemenin nasıl yapılacağı, büyük ölçüde çalışma sorusuna ve ilgilenilen türe bağlı olacak açık ve önemsiz olmayan bir sorudur. Aşağıda arazi transkriptomiği ile ilgili bazı özel konular ve hususlar özetlenmiştir.
4.2. Zamana dayalı bir süreç olarak gen ifadesi
Çoğu organizma, davranış, fizyoloji ve gen ifadesini düzenleyen zamansal çevre değişikliklerine uymak için biyolojik ritimler geliştirmiştir. Gen ifadesindeki sirkadiyen ritimler, prokaryotlardan bitkilere, mantarlara ve hayvanlara kadar geniş bir takson yelpazesinde yaygın olarak bulunur. Örneğin intertidal midyeler ve resif oluşturan mercanlar sirkadiyen ve gelgit ritimlerine, mevsimsel ve ay döngülerine yanıt olarak gen ifadelerini düzenlemektedir. Bu bulgular, coğrafi bölgelerdeki zamansal çevresel değişiklikleri hesaba katan deneylere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Ölçek, arazi ekolojisinin temelinde yer alır. Arazi, “arazi” kavramının organizma boyutuna ve dağılma yeteneğine göre değiştiği mekansal heterojenliği vurgular. Mikroplarınki gibi küçük ölçekli ortamlar, hem mikroplar hem de daha büyük organizmalarla ilgili arazi transkriptomiklerinin incelenmesi için deneysel modeller sunar.
4.3. Dokuya özgü yanıtlar ve transkriptomik çalışmalar
Çok hücreli organizmalar üzerinde çalışmalar yapılırken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önemli husus da doku seçimidir. Gen ekspresyonunda dokuya özgü farklılıklar önemli olabilir ve popülasyonlar arasında farklılık gösterebilir. Örneğin, Atlantik killifish, Fundulus heteroclitus üzerinde yapılan bir çalışmada, metabolik genlerin %76’sı beyin, kalp ve karaciğer dokuları arasında farklı şekilde ortaya çıkmıştır. Bunlardan, dokuya özgü farklılıkların yalnızca %31’i, ABD’nin doğu kıyısındaki üç popülasyondan kaynaklanan balıklar arasında ifade bakımından uyum göstermiştir. Tek bir organ içinde bile, o dokunun hücre tipleri arasındaki farklılıklar önemli olabilmektedir. Bu nedenle, hangi dokunun seçildiğini dikkatle değerlendirmek ve bu seçimin yarattığı çıkarım sınırlarını kabul etmek gerekmektedir.
4.4. Arazi transkriptomiğinin geleceği
Mikro diziler, on yıl boyunca tüm genom transkripsiyonunun ölçümü için baskın yöntem olmuştur, ancak RNAseq kullanımı, özellikle önceden genomik kaynakları olmayan türler için son zamanlarda artmıştır. Mikro diziler, daha az yaygın olmasına rağmen, çalışma tasarımlarında, örneğin uyaran tepkisini ve gen ekspresyon modellerini incelemek için, özellikle de halihazırda mevcutsa, değerli olmaya devam etmektedir. Mikro diziler ve RNAseq’in birleştirilmesi, doğal popülasyonlardaki küresel gen ifadesi modellerini test edebilmektedir.
DNA metilasyonu gibi epigenetik mekanizmalar, çevresel faktörlere yanıt olarak gen ifadesini etkileyebilmektedir. DNA dizisi farklılıkları bağlama bağlı olabilirken, DNA metilasyonu çevresel etkiye daha duyarlıdır ve doğal ortamlar potansiyel olarak kontrollü deneylerde görülmeyen alternatif metilasyon profillerini ortaya çıkarır. RNAseq ile DNA metilasyon analizlerinin birleştirilmesi, arazi ölçeğindeki çalışmalarda çevresel tepkilerin genetik mimarisi hakkında daha derin bilgiler sağlayabilmektedir.
Proteomikler, gen ifadesini işlevsel protein ürünlerine bağlayarak transkriptomik çalışmaları tamamlayacak ve çevresel stres faktörlerinin arazi ölçeğinde fenotipik değişikliklere nasıl dönüştüğünün daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
5. SONUÇ
Arazi transkriptomiği, organizmaların çeşitli mekansal ve zamansal gradyanlar boyunca moleküler düzeyde çevresel faktörlerdeki değişikliklere nasıl tepki verdiğini anlamak için fonksiyonel genomiği arazi ekolojisi ile birleştirir. Bu alan, doğal popülasyonlarda genom çapında gen ifadesini ölçmek için RNAseq ve mikro diziler gibi teknolojileri kullanarak son on yılda hızla gelişmiştir. Bu yaklaşım, gen-çevre etkileşimlerini ortaya çıkararak, iklim değişikliği bağlamında çok önemli olan stres faktörlerine ve çevresel değişikliklere adaptasyona ışık tutmaktadır.
Bununla birlikte, özellikle genomik kaynaklardan yoksun model olmayan türler için zorluklar devam etmektedir. Gelecekteki araştırmalar, çevresel tepkileri daha iyi anlamak için muhtemelen transkriptomik ile proteomik ve epigenetiği birleştirecektir. Bu entegrasyon, organizmaların çevrelerine nasıl uyum sağladığını anlamak ve tür koruma stratejilerini bilgilendirmek için anahtar olacaktır. Arazi transkriptomiği, ekolojik ve evrimsel süreçler hakkında değerli bilgiler sunarak koruma ve yönetim çabaları için umut verici bir araç haline gelmektedir.
Proteomikler, gen ifadesini işlevsel protein ürünlerine bağlayarak transkriptomik çalışmaları tamamlayacak ve çevresel stres faktörlerinin arazi ölçeğinde fenotipik değişikliklere nasıl dönüştüğünün daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Mus musculus, Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster ve A. thaliana gibi geleneksel model organizmalar, gen anotasyonları ve öngörülen etkileşimler dahil olmak üzere kapsamlı genomik kaynaklardan yararlanmaktadır. Ancak, ekologlar genellikle bu kaynaklardan yoksun olan model olmayan organizmalar üzerinde çalışırlar. Araştırmacılar en yakın model akrabanın anotasyonlarına güvenirler, ancak genetik farklılık bu anotasyonları ile yanıltabilir. Model organizmalarda bile genomların tamamı tam olarak açıklanmamıştır. Türe özgü genomik veri tabanlarının geliştirilmesi ve ek açıklamaların iyileştirilmesi, arazi transkriptomik çalışmalarının ilerletilmesi için çok önemli olacaktır.
6. KAYNAKLAR
Alneberg, J., Bennke, C., Beier, S., Bunse, C., Quince, C., Ininbergs, K., Riemann, L., et al. (2020). Ecosystem-wide metagenomic binning enables prediction of ecological niches from genomes. Communications Biology, 3(1), 119. https://doi.org/10.1038/s42003-020-0856-x
Alvarez, M., Schrey, A. W., & Richards, C. L. (2015). Ten years of transcriptomics in wild populations: What have we learned about their ecology and evolution? Molecular Ecology, 24(4), 710–725. https://doi.org/10.1111/mec.13055
Campbell-Staton, S. C., Bare, A., Losos, J. B., Edwards, S. V., & Cheviron, Z. A. (2018). Physiological and regulatory underpinnings of geographic variation in reptilian cold tolerance across a latitudinal cline. Molecular Ecology, 27(9), 2243–2255. https://doi.org/10.1111/mec.14580
Campbell-Staton, S. C., Cheviron, Z. A., Rochette, N., Catchen, J., Losos, J. B., & Edwards, S. V. (2017). Winter storms drive rapid phenotypic, regulatory, and genomic shifts in the green anole lizard. Science, 357(6350), 495–498. https://doi.org/10.1126/science.aam5512
Campbell-Staton, S. C., Winchell, K. M., Rochette, N. C., Fredette, J., Maayan, I., Schweizer, R. M., & Catchen, J. (2020). Parallel selection on thermal physiology facilitates repeated adaptation of city lizards to urban heat islands. Nature Ecology & Evolution, 4, 652–658. https://doi.org/10.1038/s41559-020-1131-8
Chelaifa, H., Mahe, F., & Ainouche, M. (2010). Transcriptome divergence between the hexaploid salt-marsh sister species Spartina maritima and Spartina alterniflora (Poaceae). Molecular Ecology, 19(10), 2050–2063. https://doi.org/10.1111/j.1365-294X.2010.04637.x
Colbourne, J. K., Pfrender, M. E., Gilbert, D., Thomas, W. K., Tucker, A., Oakley, T. H., Tokishita, S., Aerts, A., Arnold, G. J., Basu, M. K., Bauer, D. J., Cáceres, C. E., Carmel, L., Casola, C., Choi, J.-H., Detter, J. C., Dong, Q., Dusheyko, S., Eads, B. D., … Boore, J. L. (2011). The Ecoresponsive Genome of Daphnia pulex. Science, 331(6017), 555–561. https://doi.org/10.1126/science.1197761
Connor, K. M., & Gracey, A. Y. (2011). Circadian cycles are the dominant transcriptional rhythm in the intertidal mussel Mytilus californianus. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(38), 16110–16115. https://doi.org/10.1073/pnas.1111076108
Dowen, R. H., Pelizzola, M., Schmitz, R. J., Lister, R., Dowen, J. M., Nery, J. R., Dixon, J. E., & Ecker, J. R. (2012). Widespread dynamic DNA methylation in response to biotic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(32). https://doi.org/10.1073/pnas.1209329109
Keagy, J., Drummond, C. P., Gilbert, K. J., Grozinger, C. M., Hamilton, J., Hines, H. M., Lasky, et al. (2023). Landscape transcriptomics as a tool for addressing global change effects across diverse species. Molecular Ecology Resources, 1755-0998.13796. https://doi.org/10.1111/1755-0998.13796
Leakey, A. D. B., Ainsworth, E. A., Bernard, S. M., Markelz, R. J. C., Ort, D. R., Placella, S. A., Rogers, A., Smith, M. D., Sudderth, E. A., Weston, D. J., Wullschleger, S. D., & Yuan, S. (2009). Gene expression profiling: Opening the black box of plant ecosystem responses to global change. Global Chnge Biology, 15(5), 1201–1213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2486.2008.01818.x
Nagano, A. J., Sato, Y., Mihara, M., Antonio, B. A., Motoyama, R., Itoh, H., Nagamura, Y., & Izawa, T. (2012). Deciphering and Prediction of Transcriptome Dynamics under Fluctuating Field Conditions. Cell, 151(6), 1358–1369. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.10.048
Rees, B. B., Andacht, T., Skripnikova, E., & Crawford, D. L. (2011). Population Proteomics: Quantitative Variation Within and Among Populations in Cardiac Protein Expression. Molecular Biology and Evolution, 28(3), 1271–1279. https://doi.org/10.1093/molbev/msq314
Richards, C. L., Rosas, U., Banta, J., Bhambhra, N., & Purugganan, M. D. (2012). Genome-Wide Patterns of Arabidopsis Gene Expression in Nature. PLoS Genetics, 8(4), e1002662. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002662
Semeniuk, C. A. D., Jeffries, K. M., Li, T., Bettles, C. M., Cooke, S. J., Dufour, B. A., Halfyard, E. A., Heath, J. W., Keeshig, K., Mandrak, N. E., Muir, A. J., Postma, L., & Heath, D. D. (2022). Innovating transcriptomics for practitioners in freshwater fish management and conservation: Best practices across diverse resource-sector users. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 32, 921–939.
Seyfferth, C., Renema, J., Wendrich, J. R., Eekhout, T., Seurinck, R., Vandamme, N., Blob, B., Saeys, Y., Helariutta, Y., Birnbaum, K. D., & De Rybel, B. (2021). Advances and Opportunities in Single-Cell Transcriptomics for Plant Research. Annual Review of Plant Biology, 72(1), 847–866. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-081720-010120
Supplitt, S., Karpinski, P., Sasiadek, M., & Laczmanska, I. (2021). Current Achievements and Applications of Transcriptomics in Personalized Cancer Medicine. International Journal of Molecular Sciences, 22(3), 1422. https://doi.org/10.3390/ijms22031422
Swenson, N. G. (2012). The Functional Ecology and Diversity of Tropical Tree Assemblages through Space and Time: From Local to Regional and from Traits to Transcriptomes. ISRN Forestry, 2012, 1–16. https://doi.org/10.5402/2012/743617
Swenson, N. G., & Jones, F. A. (2017). Community transcriptomics, genomics and the problem of species co‐occurrence. Journal of Ecology, 105(3), 563–568. https://doi.org/10.1111/1365-2745.12771
Wagner, T., Fergus, C. E., Stow, C. A., Cheruvelil, K. S., & Soranno, P. A. (2016). The statistical power to detect cross‐scale interactions at macroscales. Ecosphere, 7(7), e01417. https://doi.org/10.1002/ecs2.1417
Whitehead, A., & Crawford, D. L. (2005). Variation in tissue-specific gene expression among natural populations. Genome Biology, 6(2), R13. https://doi.org/10.1186/gb-2005-6-2-r13
Whitehead, A., Dubansky, B., Bodinier, C., Garcia, T. I., Miles, S., Pilley, C., Raghunathan, V., Roach, J. L., Walker, N., Walter, R. B., Rice, C. D., & Galvez, F. (2012). Genomic and physiological footprint of the Deepwater Horizon oil spill on resident marsh fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(50), 20298–20302. https://doi.org/10.1073/pnas.1109545108
Whitehead, A., Zhang, S., Roach, J. L., & Galvez, F. (2013). Common functional targets of adaptive micro- and macro-evolutionary divergence in killifish. Molecular Ecology, 22(14), 3780–3796. https://doi.org/10.1111/mec.12316
Whitham, T. G., Bailey, J. K., Schweitzer, J. A., Shuster, S. M., Bangert, R. K., LeRoy, C. J., Lonsdorf, E. V., Allan, G. J., DiFazio, S. P., Potts, B. M., Fischer, D. G., Gehring, C. A., Lindroth, R. L., Marks, J. C., Hart, S. C., Wimp, G. M., & Wooley, S. C. (2006). A framework for community and ecosystem genetics: From genes to ecosystems. Nature Reviews Genetics, 7(7), 510–523. https://doi.org/10.1038/nrg1877
Wuitchik, D. M., Wang, D., Pells, T. J., Karimi, K., Ward, S., & Vize, P. D. (2019). Seasonal temperature, the lunar cycle and diurnal rhythms interact in a combinatorial manner to modulate genomic responses to the environment in a reef‐building coral. Molecular Ecology, 28(16), 3629–3641. https://doi.org/10.1111/mec.15173
